Ogniskowanie izoelektryczne w fazie ciekłej: technika elektroforezy oddzielająca cząsteczki bioaktywne od surowego ekstraktu Gymnema sylvestre

Streszczenie

Źródło: Veerapandian, R., et al. Separacja bioaktywnych małych cząsteczek, peptydów z naturalnych źródeł i białek od mikrobów metodą preparatywnego ogniskowania izoelektrycznego (IEF). J. Vis. Exp. (2020).

Ten film opisuje technikę oddzielania złożonych cząsteczek od ekstraktów roślinnych za pomocą ogniskowania izoelektrycznego w fazie ciekłej. Technika ta pomaga oczyścić złożone biomolekuły w ich stanie naturalnym, które mogą być wykorzystywane do różnych dalszych zastosowań.

Protokół

1. Separacja i oczyszczanie małych cząsteczek i peptydów z ekstraktu z Gymnema sylvestre

1. Odmierzyć 0,6 g ekstraktu roślinnego i rozpuścić w wodzie destylowanej (60 ml), mieszając w bułce przez 5 min.
   UWAGA: Każda próbka biologiczna, która jest rozpuszczalna i wolna od soli, może być użyta do separacji i oczyszczania za pomocą przyrządu do ogniskowania izoelektrycznego w fazie ciekłej (IEF). Próbki o stężeniu soli buforowej do 10 mM mogą być używane z nieznacznie zmniejszoną rozdzielczością.
2. Odwirować rozpuszczony ekstrakt roślinny o sile 10 000 x g przez 5 minut, aby usunąć nierozpuszczalne cząstki.
3. Przenieść supernatant (~60 ml) do probówki wirówkowej o pojemności 80 ml i wymieszać go z 0,6 ml amfolitu (pH 3-10) do 1% (v/v).
4. Przygotować jednostkę IEF w fazie ciekłej.
   1. Zamontuj elektrody IEF w fazie ciekłej (przycisk anoda czerwona i przycisk katody) z odpowiednimi membranami wymiennymi zgodnie z instrukcją obsługi (Tabela materiałów). Zrównoważyć membrany anionowymienne z 0,1 M NaOH, a membrany kationitowe z 0,1 M H₃PO₄ co najmniej przez 16 godzin, gdy stosowane są nowe membrany.
   2. Przechowuj membrany w elektrolitach (0,1 M NaOH lub 0,1 M H₃PO₄) między cyklami i nie pozwól im wyschnąć.
   3. Zamontuj wewnętrzną i zewnętrzną część elektrody, ustawiając trzy podłużne otwory w uszczelkach jonowymiennych. Napełnij elektrody odpowiednimi elektrolitami (~25-30 ml), aby zapobiec wysychaniu ich membran.
   4. Nie dodawaj nadmiaru (więcej niż 1/3 objętości komory elektrody) elektrolitu, który może wytworzyć ciśnienie wewnątrz elektrody i spowodować wyciek.
   5. Zakryj porty do pobierania próbek taśmą uszczelniającą, która jest dostarczana z częściami montażowymi przyrządu (tabela materiałów). Po stronie portów do pobierania próbek można rozpoznać po dwóch pionowych metalowych kołkach wyrównujących. Alternatywnie użyj standardowej taśmy uszczelniającej, aby uszczelnić porty.
   6. Zamontuj kolejno wszystkie części zespołu komory ostrości (elektroda anodowa, rdzeń membrany nylonowej, komora ostrości i elektroda katodowa) nad ceramicznym palcem chłodzącym.
   7. Napełnij komorę ostrości wstępnie schłodzoną wodą destylowaną (całkowita objętość 60 ml dla standardowej celi IEF) za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml.
   8. Podłącz przyrząd IEF w fazie ciekłej do krążącej wody chłodzącej o temperaturze 4 ºC i uruchom urządzenie przy 15 W i 3,000 V przez 3-5 minut lub do momentu, gdy napięcie się ustabilizuje.
      UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, w ciągu jednej minuty voltage osiągnie maksymalne ustawione wartości. Wstępne uruchamianie wodą destylowaną pomaga usunąć resztki jonów z komory ogniskowania i rdzenia membrany nylonowej.
   9. Wyłącz źródło zasilania i usuń wodę z ogniwa za pomocą kolektora frakcji. Ponownie uszczelnij otwory zbiorcze taśmą uszczelniającą. Komora jest teraz gotowa do załadowania próbki.
5. Użyj strzykawki o pojemności 50 ml z igłą o końcu 1-1/2 cala 19 G (w zestawie z instrumentem) i załaduj przygotowaną próbkę amfoliitem (łącznie 60 ml) do celi przez porty do pobierania próbek.
6. Usuń pęcherzyki powietrza z sample cela, wyjmując celę skupiającą ze stojaka i stukając w komorę elektrody, aby usunąć pęcherzyki. Obecność pęcherzyków powietrza spowoduje wahania napięcia i prądu oraz wpłynie na przebieg.
7. Podłączyć urządzenie do wodnego płynu chłodzącego (4 °C) i rozpocząć frakcjonowanie przy zasilaniu ze stałą mocą 15 W.
8. Uruchom aparat na 3 godziny lub do momentu, gdy napięcie osiągnie stałą wartość.
   UWAGA: Gdy próbka zacznie się skupiać, napięcie zacznie stopniowo rosnąć, aż osiągnie stałą wartość.
9. Po zakończeniu pracy przygotuj się do zebrania frakcji w skrzynce zbiorczej (zawierającej 20 plastikowych rurek o wymiarach 12 mm x 75 mm, objętości 5-6 ml) podłączonej do pompy próżniowej, naciskając przycisk zbioru ON w jednostce IEF.
10. Dopasuj kołki zbierające 20 do portów 20 odbiorników komórki ostrości, która jest uszczelniona taśmą.
11. Przepchnij kołki zbiorcze przez taśmę uszczelniającą i jednocześnie włącz pompę próżniową (Rysunek 1B, 1C i 1D).
    UWAGA: Za każdym razem do probówek zostanie zebranych około 3 ml frakcji z każdej komory. Frakcje mogą być wykorzystywane do późniejszych zastosowań (SDS-PAGE do oznaczania ilościowego peptydów, TLC i testu biologicznego dla małych cząsteczek).

Wyniki

Rysunek 1: Konfiguracja aparatu IEF w fazie ciekłej i frakcjonowanie ekstraktu roślinnego G. sylvestre. (A) podczas przebiegu, (B) podczas zbierania frakcji, (C) po zebraniu frakcji oraz (D) części aparatury IEF w fazie ciekłej, 1) membrany jonowymienne, 2) komora ogniskowania i rdzeń membrany, 3) zespół elektrod (ujemny), 4) zespół elektrod (dodatni).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Filtr strzykawkowy 0,45 μm	Fisher scientfic	Numer katalogowy: 09-720-004
Bio-Lyte 3/10 Amfolite	Bio-Rad	Nr kat. 163-1113
Bio-Lyte 5/8 Amfolite	Bio-Rad	163-1192
Kompaktowy termostat niskotemperaturowy	Lauda-Brinkmann	Zobacz materiał RM 6T	Ustaw chłodzenie wodne na 4°C i może pracować nawet w 0°C, ponieważ gdy przechodzi przez rdzeń chłodzący Rotofor, temperatura wody obiegowej będzie wynosić około 5 lub więcej w zależności od napięcia.
Ekstrakt z liści roślin Gymnema w proszku (>25% kwasów Gymnemy)	Suan Farma, NJ, Stany Zjednoczone
Mini elektroforeza proteuszowa	Bio-Rad
pH-metr	METTLER TOLEDO	Zobacz materiał S20	Przydatny do oznaczania pH frakcji Rotofor (IEF w fazie ciekłej)
Rotofor (Rotofor)	Bio-Rad	Numer katalogowy: 170-2972	http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Instrukcja montażu urządzenia Rotofor)
RPMI-1640 Średni	Klon HyClone	DH30255.01
Taśma uszczelniająca	Bio-Rad	Numer katalogowy: 170-2960	Można również użyć taśmy klejącej
Wirówka Sorvall legend micro 17	Termo naukowy	75002432