Ogniskowanie izoelektryczne w fazie ciekłej: technika elektroforezy oddzielająca cząsteczki bioaktywne od surowego ekstraktu Gymnema sylvestre

1. Separacja i oczyszczanie małych cząsteczek i peptydów z ekstraktu z Gymnema sylvestre

1. Odmierzyć 0,6 g ekstraktu roślinnego i rozpuścić w wodzie destylowanej (60 ml), mieszając w bułce przez 5 min.
   UWAGA: Każda próbka biologiczna, która jest rozpuszczalna i wolna od soli, może być użyta do separacji i oczyszczania za pomocą przyrządu do ogniskowania izoelektrycznego w fazie ciekłej (IEF). Próbki o stężeniu soli buforowej do 10 mM mogą być używane z nieznacznie zmniejszoną rozdzielczością.
2. Odwirować rozpuszczony ekstrakt roślinny o sile 10 000 x g przez 5 minut, aby usunąć nierozpuszczalne cząstki.
3. Przenieść supernatant (~60 ml) do probówki wirówkowej o pojemności 80 ml i wymieszać go z 0,6 ml amfolitu (pH 3-10) do 1% (v/v).
4. Przygotować jednostkę IEF w fazie ciekłej.
   1. Zamontuj elektrody IEF w fazie ciekłej (przycisk anoda czerwona i przycisk katody) z odpowiednimi membranami wymiennymi zgodnie z instrukcją obsługi (Tabela materiałów). Zrównoważyć membrany anionowymienne z 0,1 M NaOH, a membrany kationitowe z 0,1 M H₃PO₄ co najmniej przez 16 godzin, gdy stosowane są nowe membrany.
   2. Przechowuj membrany w elektrolitach (0,1 M NaOH lub 0,1 M H₃PO₄) między cyklami i nie pozwól im wyschnąć.
   3. Zamontuj wewnętrzną i zewnętrzną część elektrody, ustawiając trzy podłużne otwory w uszczelkach jonowymiennych. Napełnij elektrody odpowiednimi elektrolitami (~25-30 ml), aby zapobiec wysychaniu ich membran.
   4. Nie dodawaj nadmiaru (więcej niż 1/3 objętości komory elektrody) elektrolitu, który może wytworzyć ciśnienie wewnątrz elektrody i spowodować wyciek.
   5. Zakryj porty do pobierania próbek taśmą uszczelniającą, która jest dostarczana z częściami montażowymi przyrządu (tabela materiałów). Po stronie portów do pobierania próbek można rozpoznać po dwóch pionowych metalowych kołkach wyrównujących. Alternatywnie użyj standardowej taśmy uszczelniającej, aby uszczelnić porty.
   6. Zamontuj kolejno wszystkie części zespołu komory ostrości (elektroda anodowa, rdzeń membrany nylonowej, komora ostrości i elektroda katodowa) nad ceramicznym palcem chłodzącym.
   7. Napełnij komorę ostrości wstępnie schłodzoną wodą destylowaną (całkowita objętość 60 ml dla standardowej celi IEF) za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml.
   8. Podłącz przyrząd IEF w fazie ciekłej do krążącej wody chłodzącej o temperaturze 4 ºC i uruchom urządzenie przy 15 W i 3,000 V przez 3-5 minut lub do momentu, gdy napięcie się ustabilizuje.
      UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, w ciągu jednej minuty voltage osiągnie maksymalne ustawione wartości. Wstępne uruchamianie wodą destylowaną pomaga usunąć resztki jonów z komory ogniskowania i rdzenia membrany nylonowej.
   9. Wyłącz źródło zasilania i usuń wodę z ogniwa za pomocą kolektora frakcji. Ponownie uszczelnij otwory zbiorcze taśmą uszczelniającą. Komora jest teraz gotowa do załadowania próbki.
5. Użyj strzykawki o pojemności 50 ml z igłą o końcu 1-1/2 cala 19 G (w zestawie z instrumentem) i załaduj przygotowaną próbkę amfoliitem (łącznie 60 ml) do celi przez porty do pobierania próbek.
6. Usuń pęcherzyki powietrza z sample cela, wyjmując celę skupiającą ze stojaka i stukając w komorę elektrody, aby usunąć pęcherzyki. Obecność pęcherzyków powietrza spowoduje wahania napięcia i prądu oraz wpłynie na przebieg.
7. Podłączyć urządzenie do wodnego płynu chłodzącego (4 °C) i rozpocząć frakcjonowanie przy zasilaniu ze stałą mocą 15 W.
8. Uruchom aparat na 3 godziny lub do momentu, gdy napięcie osiągnie stałą wartość.
   UWAGA: Gdy próbka zacznie się skupiać, napięcie zacznie stopniowo rosnąć, aż osiągnie stałą wartość.
9. Po zakończeniu pracy przygotuj się do zebrania frakcji w skrzynce zbiorczej (zawierającej 20 plastikowych rurek o wymiarach 12 mm x 75 mm, objętości 5-6 ml) podłączonej do pompy próżniowej, naciskając przycisk zbioru ON w jednostce IEF.
10. Dopasuj kołki zbierające 20 do portów 20 odbiorników komórki ostrości, która jest uszczelniona taśmą.
11. Przepchnij kołki zbiorcze przez taśmę uszczelniającą i jednocześnie włącz pompę próżniową (Rysunek 1B, 1C i 1D).
    UWAGA: Za każdym razem do probówek zostanie zebranych około 3 ml frakcji z każdej komory. Frakcje mogą być wykorzystywane do późniejszych zastosowań (SDS-PAGE do oznaczania ilościowego peptydów, TLC i testu biologicznego dla małych cząsteczek).

Rysunek 1: Konfiguracja aparatu IEF w fazie ciekłej i frakcjonowanie ekstraktu roślinnego G. sylvestre. (A) podczas przebiegu, (B) podczas zbierania frakcji, (C) po zebraniu frakcji oraz (D) części aparatury IEF w fazie ciekłej, 1) membrany jonowymienne, 2) komora ogniskowania i rdzeń membrany, 3) zespół elektrod (ujemny), 4) zespół elektrod (dodatni).