Elektroforeza kapilarna z przesunięciem ruchliwości i powinowactwa: metoda analizy interakcji próbka-ligand w zależności od zróżnicowanej migracji kompleksów białko-ligand

Abstract

Źródło: Nachbar M. et al., Analiza wewnętrznego zaburzenia AtHIRD11 i wiązania z jonami metali przez elektroforezę w żelu kapilarnym i elektroforezę kapilarną o powinowactwie. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film opisuje metodę analizy interakcji białko-ligand za pomocą elektroforezy kapilarnej z przesunięciem ruchliwości. Metoda ta może być stosowana do charakteryzowania zachowania wiązania białka z różnymi naładowanymi ligandami.

Protocol

1. Przygotuj rozwiązania do analizy ACE

1. Przygotować 1 M roztwór NaOH.
   1. Odważyć 4,0 g NaOH w kolbie miarowej o pojemności 100 ml.
   2. Napełnij go do kreski wodą dejonizowaną, aby uzyskać zapas o pojemności 1 M.
2. Przygotować 0,1 M kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) w 0,1 M roztworze NaOH.
   1. Przenieść 10 ml 0,1 M NaOH do kolby miarowej o pojemności 100 ml za pomocą pipety z bańką o pojemności 10 ml. Napełnij go do kreski wodą dejonizowaną.
   2. Zważyć 2,42 g EDTA na łodzi wagowej i rozpuścić związek stały w 100 ml 0,1 M NaOH.
3. Przygotować roztwór buforowy Tris (30 mM).
   1. Do zlewki o pojemności 500 ml dodać 3,63 g Tris, 200 ml wody dejonizowanej i kostkę mieszającą. Umieść zlewkę na płytce mieszającej i włącz ją.
   2. Umieścić elektrodę pH-metru w zlewce i dostosować pH do 7,4 za pomocą 0,1 M HCl.
   3. Napełnij roztwór kolbą miarową o pojemności 1 l i napełnij do kreski wodą dejonizowaną.
      UWAGA: Procedurę tę należy powtórzyć lub potrzebna jest większa kolba miarowa, ponieważ do całej analizy potrzeba więcej niż 1 l.
4. Przygotować roztwór markera przepływu elektroosmotycznego (EOF) acetanilidu (60 μM).
   1. Dodać 6 mg acetanilidu i 100 ml buforu Tris do kolby miarowej o pojemności 100 ml.
   2. Umieścić kolbę miarową w łaźni ultradźwiękowej i włączyć ją na 30 minut.
5. Przygotować roztwór próbki (1 mg/ml).
   1. Umieść probówkę mikrowirówki o pojemności 0,5 ml na wadze precyzyjnej i dodaj 0,3 mg liofilizowanego proszku AtHIRD11 do probówki.
   2. Za pomocą mikropipety dodaj 0,3 ml 30 mM buforu Tris (pH 7,4) do probówki. Ostrożnie wstrząśnij probówką, aby rozpuścić białko.
6. Przygotuj roztwory ligandów.
   1. Przygotować roztwór podstawowy CaCl₂ (5 mM).
      1. Weź łódkę wagową, umieść ją na wadze analitycznej i zważ 36,76 mg CaCl₂*_H2O.
      2. Za pomocą mikropipety przepłukać CaCl₂*_H2Oz łodzi ważącej do kolby miarowej o pojemności 50 ml z uprzednio przygotowanym buforem Tris.
      3. Napełnić kolbę miarową buforem Tris do kreski.
   2. Przygotować pozostałe roztwory podstawowe (5 mM).
      1. Powtórz krok 1.6.1, używając innych soli metali zamiast CaCl₂*_H2O[MgCl₂: 23,80 mg, BaCl₂: 26,02 mg, Sr(NO₃)₂: 52,91 mg, MnCl₂: 31,46 mg, SeCl₄: 52,91 mg, CoCl₂*2H₂O: 41,47 mg, CuCl₂*2H₂O: 42,62 mg, ZnCl₂: 3,41 mg i NiCl₂*6H₂O: 59,43 mg].
         nuta: Roztwór ZnCl₂ ma stężenie 0,5 mM. Ponieważ zaobserwowano silne oddziaływania między jonami a wewnętrzną ścianą naczyń włosowatych, stężenie zmniejszyło się o współczynnik 10⁴.
   3. Przygotować roztwór CaCl₂ o stężeniu 500 μM.
      1. Napełnić 10 ml roztworu podstawowego CaCl₂ i umieścić go w kolbie miarowej o pojemności 100 ml.
      2. Napełnić kolbę miarową buforem Tris do kreski i wstrząsnąć kolbą.
   4. Przygotować roztwór CaCl₂ o stężeniu 250 μM.
      1. Napełnić 5 ml roztworu podstawowego CaCl₂ i umieścić go w kolbie miarowej o pojemności 100 ml.
      2. Napełnić kolbę miarową buforem Tris do kreski i wstrząsnąć kolbą.
   5. Powtórz poprzednie kroki dla pozostałych roztworów podstawowych.
7. Napełnij roztwory w fiolkach.
   nuta: Każdy powtarzający się przebieg wymaga zestawu fiolek wlotowych i wylotowych. Zastosowanie świeżych roztworów ligandów na wlocie i wylocie zmniejsza przesunięcia w czasie migracji po każdym przebiegu.
   1. Napełnić 250 μM roztworem CaCl₂ w strzykawce o pojemności 10 ml.
   2. Umieścić filtr PVDF 0,22 μm na strzykawce i przepchnąć 2 ml roztworu przez filtr za pomocą strzykawki w celu odrzucenia przefiltrowanego roztworu.
   3. Napełnić 10 fiolek do maksymalnej dozwolonej objętości pozostałym roztworem 250 μM CaCl₂ ze strzykawki. Oznaczyć każdą z nich jako fiolkę wlotową roztworu CaCl₂ o objętości 250 μM.
   4. Napełnić 10 fiolek do połowy roztworem CaCl₂ o stężeniu 250 μM. Oznaczyć każdą z nich jako fiolkę z wylotem roztworu CaCl₂ o stężeniu 250 μM.
   5. Powtórzyć kroki 1.7.1 - 1.7.4 dla pozostałych roztworów zawierających sól metali.
   6. Powtórz kroki dla każdej pary fiolek wlotowych i wylotowych, używając zamiast tego roztworu buforowego Tris o stężeniu 30 mM (pH 7,4).
      nuta: Bufor Tris o pH 7,4 o stężeniu 30 mmol/l jest używany pomiędzy seriami w celu uzyskania danych dotyczących czasu migracji białka przy braku jonów metali. Konieczne jest zaniedbanie zmian w EOF.
   7. Powtórzyć powyższe czynności dla jednej fiolki, używając roztworu markera EOF acetanilidu (60 μM). Powtórz również te kroki, używając roztworu próbki (1 mg/ml).

2. Analiza elektroforetyczna kapilarna o powinowactwie

1. Kondycjonuj naczynia włosowate
   1. Ustaw termostat na 23 °C.
      nuta: Temperatura jest używana zgodnie z opublikowanymi protokołami i może być zmieniona na inne temperatury. Jednak interakcje są zależne od temperatury i odpowiednio się zmieniają.
   2. Przepłukać kapilarnę przez 40 minut pod ciśnieniem 2,5 bara 0,1 M NaOH.
   3. Przepłukiwać kapilarnę przez 10 minut pod ciśnieniem 1,0 bara wodą dejonizowaną.
   4. Przepłukiwać kapilarnę przez 30 minut pod ciśnieniem 1,0 bara za pomocą 30 mM buforu Tris (pH 7,4).
2. Przygotowanie do metod ACE
   1. Przygotuj metodę pomiarów bez ligandów.
      nuta: Acetanilid nie został dodany do roztworu próbki, ponieważ ukrywa on 2 piki białka.
      1. Przepłukać kapilarnę przez 1 minutę pod ciśnieniem 2,5 bara 0,1 M roztworem EDTA.
      2. Płukać kapilarnę przez 1 minutę pod ciśnieniem 2,5 bara wodą dejonizowaną.
      3. Przepłukać kapilarnę przez 1,5 minuty pod ciśnieniem 2,5 bara za pomocą buforu Tris w celu zrównoważenia.
      4. Wstrzykiwać roztwór acetanilidu przez 6 s pod ciśnieniem 0,05 bara i wymienić fiolki wlotowe i wylotowe na fiolki z buforem Tris.
      5. Stosować 0,05 bara przez 2,4 s, aby wepchnąć roztwór acetanilidu z końcówki kapilary głębiej do środka.
      6. Zastosować napięcie 10,0 kV przez 6 minut i wykryć pik acetanilidu o długości fali 200 nm.
      7. Powtórzyć czynności 2.2.1.1-2.2.1.6, używając próbki białka zamiast roztworu acetanilidu i wykryć wszystkie piki białka.
   2. Przygotuj metodę pomiarów za pomocą ligandów.
      1. Przepłukać kapilarnę przez 1 minutę pod ciśnieniem 2,5 bara 0,1 M roztworem EDTA.
      2. Płukać kapilarnę przez 1 minutę pod ciśnieniem 2,5 bara wodą dejonizowaną.
      3. Przepłukać kapilarę przez 1,5 minuty pod ciśnieniem 2,5 bara roztworem liganda w celu zrównoważenia.
      4. Wstrzykiwać roztwór acetanilidu przez 6 s pod ciśnieniem 0,05 bara i zmienić fiolki wlotowe i wylotowe na fiolki z buforem zawierającym ligandy.
      5. Stosować 0,05 bara przez 2,4 s, aby wepchnąć roztwór acetanilidu z końcówki kapilary głębiej do środka.
      6. Zastosować napięcie 10,0 kV przez 6 minut i wykryć pik acetanilidu o długości fali 200 nm.
      7. Powtórzyć kroki 2.2.2.1 - 2.2.2.6, używając próbki białka zamiast roztworu acetanilidu i wykryć wszystkie piki białka.
   3. Alternatywnie powtarzać kroki 2.2.1 i 2.2.2 w celu obliczenia zmiany stosunku wielkości ładunku do różnych oddziaływań białko-jon metal.
      1. Zmieniaj roztwór białkowy co 60 godzin na świeży.
         nuta: W tym momencie eksperyment może zostać wstrzymany. Procedura ta jest powtarzana co najmniej 10 razy dla każdego stężenia ligandów, ponieważ wzór pików różni się nieznacznie w zależności od przebiegu. Jeśli roztwór jest używany dłużej niż 60 godzin, różnice stają się zbyt duże.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Próbka AtHIRD11	Uniwersytet Shizuoka (Grupa: Prof. M. Hara)		Białko dehydryny z Arabidopsis thaliana ulegające ekspresji w Escherichia coli
Kapilara z krzemionki baodrzuconej,	Polymicro Technologies (Phoenix, Stany Zjednoczone)	Numer katalogowy: 106815-0017	TSP050375 Średnica wewnętrzna 50 μm, średnica zewnętrzna 363 μm, powłoka poliimidowa
Agilent 1600A	Agilent Technologies (Waldbronn, Niemcy)		Przyrząd do elektroforezy kapilarnej; Zamiast tego można użyć Agilent 7100 CE
Pipeta gruszkowa 25 ml	Duran Group GmbH(Moguncja, Niemcy)	24 338 14	Przygotowanie roztworu liganda
Kolba miarowa ze szkła Duran 25 ml	Duran Group GmbH(Moguncja, Niemcy)	24 671 1457	Przygotowanie roztworu podstawowego liganda
Kolba miarowa Duran glas 10 ml	Duran Group GmbH(Moguncja, Niemcy)	24 671 1054	Przygotowanie roztworu podstawowego liganda
Acetanilid	Sigma-Aldrich (Steinheim, Niemcy)	397229-5G	Elektroosmotyczny znacznik przepływu
Chlorek manganu(II)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Niemcy)	Numer katalogowy: 13217	Ligand
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Niemcy)	Numer katalogowy: 431788-100G	Składnik do płukania
Chlorek baru	Sigma-Aldrich (Steinheim, Niemcy)	202738-5G	Ligand
Chlorek niklu(II) sześciowodny	Sigma-Aldrich (Steinheim, Niemcy)	Numer katalogowy: 654507-5G	Ligand
Chlorek selenu(IV)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Niemcy)	323527-10G	Ligand
2-amino-2-hydroksymetylopropano-1,3-diol (Tris)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Niemcy)	252859-100G	Składnik buforowy
Chlorek(II)	Merck Millipore ( Darmstadt, Niemcy)	1088160250	Ligand
Azotan strontu	Merck Millipore ( Darmstadt, Niemcy)	1078720250	Ligand
Chlorek wapnia dwuwodny	Merck Millipore ( Darmstadt, Niemcy)	1371015000	Ligand
Chlorek miedzi(II) dwuwodny	Riedel-de Haën (Seelze, Niemcy)	Numer katalogowy: 31286	Ligand
Agilent ChemStation Rev. 8.04.03- SP1	Agilent Technologies (Waldbronn, Niemcy)	G2070-91126	Pakiety oprogramowania do obsługi przyrządów CE, pozyskiwania danych i ich oceny