Elektroforeza kapilarna z przesunięciem ruchliwości i powinowactwa: metoda analizy interakcji próbka-ligand w zależności od zróżnicowanej migracji kompleksów białko-ligand

Streszczenie

Źródło: Nachbar M. et al., Analiza wewnętrznego zaburzenia AtHIRD11 i wiązania z jonami metali przez elektroforezę w żelu kapilarnym i elektroforezę kapilarną o powinowactwie. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film opisuje metodę analizy interakcji białko-ligand za pomocą elektroforezy kapilarnej z przesunięciem ruchliwości. Metoda ta może być stosowana do charakteryzowania zachowania wiązania białka z różnymi naładowanymi ligandami.

Protokół

1. Przygotuj rozwiązania do analizy ACE

1. Przygotować 1 M roztwór NaOH.
   1. Odważyć 4,0 g NaOH w kolbie miarowej o pojemności 100 ml.
   2. Napełnij go do kreski wodą dejonizowaną, aby uzyskać zapas o pojemności 1 M.
2. Przygotować 0,1 M kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) w 0,1 M roztworze NaOH.
   1. Przenieść 10 ml 0,1 M NaOH do kolby miarowej o pojemności 100 ml za pomocą pipety z bańką o pojemności 10 ml. Napełnij go do kreski wodą dejonizowaną.
   2. Zważyć 2,42 g EDTA na łodzi wagowej i rozpuścić związek stały w 100 ml 0,1 M NaOH.
3. Przygotować roztwór buforowy Tris ....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Próbka AtHIRD11	Uniwersytet Shizuoka (Grupa: Prof. M. Hara)		Białko dehydryny z Arabidopsis thaliana ulegające ekspresji w Escherichia coli
Kapilara z krzemionki baodrzuconej,	Polymicro Technologies (Phoenix, Stany Zjednoczone)	Numer katalogowy: 106815-0017	TSP050375 Średnica wewnętrzna 50 μm, średnica zewnętrzna 363 μm, powłoka poliimidowa
Agilent 1600A	Agilent Technologies (Waldbronn, Niemcy)		Przyrząd do elektroforezy kapilarnej; Zamiast tego można użyć Agilent 7100 CE
Pipeta gruszkowa 25 ml	Duran Group GmbH(Moguncja, Niemcy)	24 338 14	Przygotowanie roztworu liganda
Kolba miarowa ze szkła Duran 25 ml	Duran Group GmbH(Moguncja, Niemcy)	24 671 1457	Przygotowanie roztworu podstawowego liganda
Kolba miarowa Duran glas 10 ml	Duran Group GmbH(Moguncja, Niemcy)	24 671 1054	Przygotowanie roztworu podstawowego liganda
Acetanilid	Sigma-Aldrich (Steinheim, Niemcy)	397229-5G	Elektroosmotyczny znacznik przepływu
Chlorek manganu(II)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Niemcy)	Numer katalogowy: 13217	Ligand
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Niemcy)	Numer katalogowy: 431788-100G	Składnik do płukania
Chlorek baru	Sigma-Aldrich (Steinheim, Niemcy)	202738-5G	Ligand
Chlorek niklu(II) sześciowodny	Sigma-Aldrich (Steinheim, Niemcy)	Numer katalogowy: 654507-5G	Ligand
Chlorek selenu(IV)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Niemcy)	323527-10G	Ligand
2-amino-2-hydroksymetylopropano-1,3-diol (Tris)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Niemcy)	252859-100G	Składnik buforowy
Chlorek(II)	Merck Millipore ( Darmstadt, Niemcy)	1088160250	Ligand
Azotan strontu	Merck Millipore ( Darmstadt, Niemcy)	1078720250	Ligand
Chlorek wapnia dwuwodny	Merck Millipore ( Darmstadt, Niemcy)	1371015000	Ligand
Chlorek miedzi(II) dwuwodny	Riedel-de Haën (Seelze, Niemcy)	Numer katalogowy: 31286	Ligand
Agilent ChemStation Rev. 8.04.03- SP1	Agilent Technologies (Waldbronn, Niemcy)	G2070-91126	Pakiety oprogramowania do obsługi przyrządów CE, pozyskiwania danych i ich oceny