Zastosowanie permanentnego podwiązania środkowej tętnicy mózgowej u myszy

Podsumowanie

Podwiązanie tętnicy środkowej mózgu (MCA) jest techniką służącą do badania ogniskowego niedokrwienia mózgu w modelach zwierzęcych. W tej metodzie tętnica środkowa mózgu zostaje odsłonięta poprzez kraniotomię, a następnie podwiązana poprzez kauteryzację. Metoda ta zapewnia wysoką powtarzalność objętości zawałów oraz zwiększoną przeżywalność pooperacyjną w porównaniu z innymi dostępnymi metodami.

Streszczenie

Ogniskowe niedokrwienie mózgu jest jednym z najczęstszych rodzajów udarów występujących u pacjentów. Ze względu na znaczenie kliniczne od dawna podejmowane są wysiłki w celu opracowania odpowiednich modeli zwierzęcych do badania procesów zachodzących podczas niedokrwiennego uszkodzenia. Techniki te obejmują modele niedokrwienia przejściowego lub trwałego, ogniskowego lub globalnego, z wykorzystaniem wielu różnych modeli zwierzęcych, z których najczęściej stosowane są gryzonie.

Metoda trwałego podwiązania tętnicy mózgowej środkowej (MCA), określana w literaturze jako pMCAo, jest szeroko stosowana jako model niedokrwienia ogniskowego u gryzoni ^1-6. Metoda ta została pierwotnie opisana dla szczurów przez Tamurę i współpracowników w 1981 roku ⁷. W tym protokole zastosowano kraniotomię w celu uzyskania dostępu do MCA, a obszary proksymalne zamknięto za pomocą elektrokoagulacji. Zawały obejmują głównie obszary korowe, a niekiedy również prążkowie, w zależności od miejsca zamknięia naczynia. Technika ta jest obecnie dobrze ugruntowana i stosowana w wielu laboratoriach ^8-13. Wczesne zastosowanie tej metody doprowadziło do zdefiniowania i opisania „rdzenia zawału” oraz „penumbry” ^14-16, a sama metoda często służy do oceny potencjalnych związków neuroprotekcyjnych ^{10, 12, 13, 17}. Chociaż pierwsze badania przeprowadzono na szczurach, trwałe podwiązanie MCA z powodzeniem stosowano również u myszy po wprowadzeniu niewielkich modyfikacji ^18-20.

Model ten pozwala na uzyskanie powtarzalnych ognisk udaru oraz zwiększa przeżywalność zwierząt. Około 80% udarów niedokrwiennych u ludzi występuje w obszarze MCA ²¹, w związku z czym jest to bardzo istotny model dla badań nad udarem. Obecnie dostępnych jest niewiele skutecznych metod leczenia pacjentów po udarze, dlatego istnieje zapotrzebowanie na rzetelne modele do testowania potencjalnych związków farmakologicznych i oceny wyników fizjologicznych. Metoda ta może być również wykorzystana do badania mechanizmów odpowiedzi na hipoksję wewnątrzkomórkową in vivo.

W niniejszym materiale przedstawiamy procedurę chirurgicznego podwiązania tętnicy środkowej mózgu (MCA) u myszy C57/BL6. Opisujemy przygotowanie przedoperacyjne, zabieg podwiązania MCA oraz barwienie chlorkiem 2,3,5-trifenylo-tetrazolium (TTC) w celu ilościowego oznaczenia objętości zawałów.

Protokół

Protokół ten został zatwierdzony przez komisję University of Rochester ds. etycznego wykorzystania zwierząt w badaniach (UCAR). Podczas realizacji protokołu należy stosować techniki aseptyczne. Wymagane jest użycie sterylnych rękawiczek i maski.

Wszystkie urządzenia, materiały, odczynniki i narzędzia wykorzystywane w protokole zostały opisane w Tabeli 1.

1. Przygotowanie przedoperacyjne

1. Wstrzyknąć myszom podskórnie buprenorfinę (0,05mg/kg) 2 h przed operacją, bezpośrednio po zabiegu, a następnie co 3-5 h w ciągu pierwszych 24 h okresu pooperacyjnego.
2. Wszystkie narzędzia chirurgiczne, gazy i aplikatory z watką wysterylizować w autoklawie. Narzędzia chirurgiczne przechowywać w 70% etanolu podczas operacji i osuszać na sterylnej gazie bezpośrednio przed użyciem. Pole robocze spryskać 70% etanolu.
3. Zanestezjować mysz mieszaniną gazową 3% izofluranu i 20% tlenu przy użyciu waporyzatora anestetycznego. Ilość tlenu dostosować za pomocą przepływomierza. Poziom znieczulenia sprawdzić poprzez uciśnięcie palca u nogi lub ogona (mysz nie powinna reagować). Poziom znieczulenia utrzymywać przy użyciu 2% (v/v) izofluranu.
4. Do oczu myszy wprowadzić sztuczne łzy i zachować ostrożność, aby nie uszkodzić oka podczas procedury chirurgicznej. Ułożyć mysz na prawym boku w pozycji bocznej.
5. Wygolić obszar po lewej stronie między lewym okiem a nasadą lewego ucha za pomocą trymera do zwierząt. Oczyścić ten obszar, na zmianę stosując roztwór betadyny i 70% etanolu, delikatnie pocierając go aplikatorami z watką. Powtórzyć w razie potrzeby.
6. Umieścić mysz na macie grzewczej połączonej z sondą rektalną w celu utrzymania temperatury ciała na poziomie 37°C. Sondę rektalną wprowadzić przy użyciu oleju mineralnego.
7. Ułożyć mysz na prawym boku pod mikroskopem i unieruchomić za pomocą taśmy. Wyciąć otwór w gazie i przykryć obszar operacyjny.

2. Procedura chirurgiczna i ligacja MCA

1. Za pomocą cienkich prostych nożyczek wykonaj nacięcie pionowe pomiędzy lewym okiem a podstawą lewego ucha. Użyj zakrzywionych kleszczyków hemostatycznych, aby utrzymać pole operacyjne otwarte.
2. Za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj nacięcie poziome w obrębie mięśnia skroniowego i delikatnie oddziel go od czaszki, powoli pociągając pęsetą.
3. Wykonaj niewielką kraniotomię podskroniową w miejscu połączenia łuku jarzmowego i kości łuskowatej za pomocą igły 18G, przytrzymując żuchwę zakrzywioną pęsetą.
4. Odsłoń MCA, usuwając niewielkie fragmenty czaszki kleszczami kostnymi. Podczas tego procesu łuk jarzmowy oraz zawartość oczodołu nie powinny zostać uszkodzone. W przypadku nadmiernego wysuszenia tkanek podczas tej procedury, nanieś sterylny PBS za pomocą aplikatorów z bawełnianą końcówką.
5. Podwiąż dystalną część MCA za pomocą kauteryzatora do małych naczyń.
6. Przywróć mięsień skroniowy do pierwotnej pozycji i zamknij miejsce nacięcia chirurgicznymi szwami nylonowymi 5-0.
7. Przerwij znieczulenie i usuń sondę rektalną. Wstrzyknij myszy podskórnie drugą dawkę buprenorfiny (0.05mg/kg). Umieść mysz w klatce utrzymywanej w temperaturze 37°C za pomocą panelu grzewczego.
8. Przez następne 24 h uważnie monitoruj mysz pod kątem wystąpienia oznak dyskomfortu (zmniejszony apetyt/spożycie wody, zgarbiona postawa, przyspieszony oddech, sterczenie sierści). Przez pierwsze 24 h po operacji wstrzykuj myszy buprenorfinę podskórnie co 3-5 h. W tym okresie zapewnij myszy żel regeneracyjny.

3. Barwienie TTC i wyznaczanie objętości zawału

1. Dwudziest cztery godziny po operacji głęboko znieczul mysz, a następnie przeprowadź perfuzję transkardialną 4% (w/v) TTC w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) przez 15 min, a następnie 4% roztworem paraformaldehydu przez 10 min, używając miniaturowej pompy perystaltycznej przy średnim natężeniu przepływu. Wyjmij mózg i umieść go w 4% roztworze paraformaldehydu na całą noc.
2. Ustaw mózg w bloku do sekcjonowania. Potnij mózg na plastry o grubości 1mm, używając żyletek.
3. Umieść plastry obok linijki milimetrowej. Wykonaj zdjęcia plastrów za pomocą aparatu cyfrowego podłączonego do mikroskopu sekcyjnego.
4. Oblicz pole powierzchni udaru, odejmując obszar niezawałowy po stronie ipsilateralnej od całkowitej powierzchni po stronie kontralateralnej, korzystając z oprogramowania Image J (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Oblicz objętość udaru poprzez zsumowanie pól powierzchni udaru poszczególnych plastrów ²².

4. Instrukcja korzystania z oprogramowania Image J

1. Otwórz plik obrazu do analizy w oprogramowaniu Image J, korzystając z menu plików.
2. Kliknij zakładkę „straight line” (linia prosta) w programie. Narysuj linię prostą między dwoma znacznikami na linijce. Kliknij menu „analyze” (analiza) i wybierz „set scale” (ustaw skalę). Wpisz znaną odległość jako 1, a jednostkę długości jako mm.
3. Kliknij zakładkę „freehand circle” (okrąg odręczny). Narysuj okrąg, aby obrysować półkulę przeciwległą. Kliknij menu „analyze” i wybierz „measure” (pomiar). Pojawi się okno obliczeń wyświetlające pole powierzchni narysowanego okręgu.
4. Narysuj kolejny okrąg wokół półkuli ipsilateralnej, wyłączając obszar udaru (biały). Zmierz pole powierzchni zgodnie z instrukcją w kroku 4.3. Nowa wartość zostanie dodana do okna obliczeń. Różnica między pierwszą a drugą wartością reprezentuje pole powierzchni zawału, oznaczone jako A w poniższej formule.
5. Oblicz pole udaru w każdym przekroju, powtarzając kroki 4.2-4.4. Oblicz sumę pól udaru wyznaczonych dla każdego przekroju (∑A_n). Reprezentuje to objętość udaru, biorąc pod uwagę, że grubość każdego przekroju wynosi 1mm.
   ∑A_n x 1mm (grubość każdego przekroju) = Objętość udaru

5. Reprezentatywne wyniki:

Zawały uzyskane poprzez trwałe podwiązanie tętnicy mózgowej środkowej (MCA) u myszy obejmują głównie korę mózgową. Możliwe jest jednak uzyskanie uszkodzeń podkorowych, jeśli MCA zostanie podwiązana proksymalnie w stosunku do gałęzi soczewkowo-prążkowianej. Objętości zawału po podwiązaniu MCA mogą wynosić od 10mm³ do 35mm³ ^{19, 23}. Objętości zawału obliczone za pomocą barwienia TTC w pracy Moyanova i wsp. ¹⁹ mieszczą się w przedziale od 10mm³ do 22mm³, podczas gdy objętości zawału określone na podstawie obrazów MRI w pracy Filiano i wsp. ²³ wynoszą od 20mm³ do 35mm³. Prawdopodobną przyczyną tych różnic może być dokładna lokalizacja podwiązania oraz zastosowanie różnych metod pomiaru objętości zawału.

Na rysunku 1 przedstawiono mózg myszy szczepu C57/BL6 typu dzikiego barwiony TTC 24 h po permanentnej ligacji tętnicy środkowej mózgu (MCA). Obszar udaru ma biały kolor (Rys. 1A, B). Rysunki 1A i B ilustrują miejsce zawału pod różnymi kątami. Rysunek 2 przedstawia plastry barwionego TTC mózgu z udarem o grubości 1 mm, od strony przedniej do tylnej (Rys. 2A-G). Objętość zawału obliczono 24 h po zabiegu. Objętość zawału wynosi ˜23mm³.

Rycina 1. Przedstawienie miejsca udaru. A-B, obrazy całego mózgu barwione TTC, 24 h po podwiązaniu MCA. Biały obszar reprezentuje obszar zawału.

Rysunek 2. Reprezentatywne wyniki. (A>G), przekroje mózgu o grubości 1mm barwione TTC, 24 h po MCAL. Przekroje są ułożone od przedniej do tylnej części. Biały obszar reprezentuje infarct.

Dyskusja

Metoda trwałej ligacji tętnicy środkowej mózgu (MCA) pozwala na uzyskanie wysoce powtarzalnych objętości zawałów oraz zwiększa przeżywalność pooperacyjną w porównaniu z innymi dostępnymi metodami. Prostota i krótki czas trwania procedury (˜30 min) czynią ją jeszcze bardziej praktyczną. Metoda ta jest powszechnie stosowana zarówno u myszy, jak i u szczurów.

Technika ta wymaga inwazyjnego zabiegu chirurgicznego pod stereomikroskopem. Dlatego niezbędne jest doświadczenie w operowaniu pod mikrosko...