Zastosowanie trwałego podwiązania środkowej tętnicy mózgowej u myszy

Podsumowanie

Podwiązanie tętnicy środkowej mózgu (MCA) jest techniką służącą do badania ogniskowego niedokrwienia mózgu w modelach zwierzęcych. W tej metodzie tętnica środkowa mózgu zostaje odsłonięta poprzez kraniotomię, a następnie podwiązana za pomocą kauteryzacji. Metoda ta zapewnia wysoką powtarzalność objętości zawału oraz zwiększoną przeżywalność pooperacyjną w porównaniu z innymi dostępnymi metodami.

Streszczenie

Ogniskowe niedokrwienie mózgu należy do najczęstszych typów udaru występujących u pacjentów. Ze względu na znaczenie kliniczne podjęto długotrwałe wysiłki w celu opracowania odpowiednich modeli zwierzęcych do badania zjawisk rozwijających się podczas niedokrwienia. Techniki te obejmują modele niedokrwienia przejściowego lub trwałego, ogniskowego lub globalnego, z wykorzystaniem wielu różnych gatunków zwierząt, z których najczęściej stosowane są gryzonie.

Metoda trwałego podwiązania tętnicy środkowej mózgu (MCA), określana w literaturze również jako pMCAo, jest powszechnie stosowana jako model niedokrwienia ogniskowego u gryzoni ^1-6. Metoda ta została pierwotnie opisana dla szczurów przez Tamurę i współpracowników w 1981 roku ⁷. W tym protokole w celu uzyskania dostępu do MCA wykonano kraniotomię, a obszary proksymalne zamknięto za pomocą elektrokoagulacji. Obszary zawału obejmują głównie korę mózgową, a niekiedy również prążkowie, w zależności od miejsca zamknięcia naczynia. Technika ta jest obecnie dobrze ugruntowana i stosowana w wielu laboratoriach ^8-13. Wczesne zastosowanie tej metody doprowadziło do zdefiniowania i opisania „rdzenia zawału” (infarct core) oraz „penumbry” ^14-16, a obecnie często służy ona do oceny potencjalnych związków neuroprotekcyjnych ^{10, 12, 13, 17}. Chociaż wstępne badania przeprowadzono na szczurach, trwałe podwiązanie MCA stosuje się z sukcesem również u myszy po wprowadzeniu niewielkich modyfikacji ^18-20.

Model ten pozwala na uzyskanie powtarzalnych ognisk zawału oraz zwiększa wskaźniki przeżywalności. Około 80% udarów niedokrwiennych u ludzi występuje w obszarze MCA ²¹, co czyni go bardzo istotnym modelem w badaniach nad udarem. Obecnie dostępna jest niewielka liczba skutecznych metod leczenia pacjentów po udarze, w związku z czym istnieje zapotrzebowanie na dopracowane modele do testowania potencjalnych związków farmakologicznych i oceny wyników fizjologicznych. Metoda ta może być również wykorzystywana do badania wewnątrzkomórkowych mechanizmów odpowiedzi na hipoksję in vivo.

W niniejszym materiale przedstawiamy zabieg ligacji tętnicy środkowej mózgu (MCA) u myszy C57/BL6. Opisujemy przygotowanie przedoperacyjne, zabieg ligacji MCA oraz barwienie chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazoliem (TTC) w celu ilościowego określenia objętości zawałów.

Protokół

Niniejszy protokół został zatwierdzony przez komisję University of Rochester ds. etycznego wykorzystania zwierząt w badaniach (UCAR). Podczas realizacji protokołu należy przestrzegać technik aseptycznych. Wymagane jest stosowanie sterylnych rękawiczek oraz maski.

Wszystkie urządzenia, materiały, odczynniki i narzędzia wykorzystywane podczas protokołu zostały opisane w Tabeli 1.

1. Przygotowanie przedoperacyjne

1. Wstrzyknąć myszom podskórnie buprenorfinę (0,05mg/kg) 2 h przed operacją, bezpośrednio po zabiegu, a następnie co 3-5 h w ciągu pierwszych 24 h okresu pooperacyjnego.
2. Wszystkie narzędzia chirurgiczne, gazy i aplikatory z bawełnianą końcówką wysterylizować w autoklawie. Narzędzia chirurgiczne przechowywać w 70% etanolu podczas operacji i osuszać na sterylnej gazie bezpośrednio przed użyciem. Obszar roboczy spryskać 70% etanolem.
3. Zanestezjować mysz mieszaniną gazową 3% izofluranu i 20% tlenu za pomocą waporyzatora anestetycznego. Ilość tlenu dostosować za pomocą przepływomierza. Poziom znieczulenia sprawdzić poprzez uciskanie palca u nogi lub ogona (zwierzę powinno nie reagować). Poziom anestezji podtrzymać za pomocą 2% (v/v) izofluranu.
4. Nanieść sztuczne łzy do oczu myszy i zachować ostrożność, aby nie uszkodzić oka podczas procedury chirurgicznej. Umieścić mysz na prawym boku w pozycji bocznej.
5. Wygolić obszar po lewej stronie między lewym okiem a podstawą lewego ucha za pomocą maszynki do strzyżenia zwierząt. Oczyścić ten obszar, naprzemiennie stosując roztwór betadyny i 70% etanolu za pomocą aplikatorów z bawełnianą końcówką, delikatnie pocierając skórę. Powtórzyć w razie potrzeby.
6. Umieścić mysz na macie grzewczej połączonej z sondą rektalną, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37°C. Sondę rektalną wprowadzić przy użyciu oleju mineralnego.
7. Ułożyć mysz na prawym boku pod mikroskopem i przymocować taśmą. Wyciąć otwór w gazie i przykryć obszar operacyjny.

2. Procedura chirurgiczna i ligacja MCA

1. Za pomocą cienkich prostych nożyczek wykonaj pionowe nacięcie między lewym okiem a nasadą lewego ucha. Użyj zakrzywionych kleszczyków hemostatycznych, aby utrzymać pole operacyjne otwarte.
2. Za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj poziome nacięcie mięśnia skroniowego, a następnie delikatnie oddziel mięsień skroniowy od czaszki, powoli pociągając go pęsetą.
3. Trzymając kość żuchwy zakrzywioną pęsetą, wykonaj niewielką kraniotomię podskroniową w miejscu połączenia łuku jarzmowego i kości łuskowatej, używając igły 18G.
4. Odsłoń MCA, usuwając niewielkie fragmenty czaszki kleszczami kostnymi. Podczas tego procesu łuk jarzmowy i zawartość oczodołu nie powinny zostać uszkodzone. Jeśli dojdzie do nadmiernego wysuszenia tkanek, nanieś sterylny PBS za pomocą aplikatorów z bawełnianą końcówką.
5. Podwiąż dystalną część MCA, używając kauteryzatora do małych naczyń.
6. Przywróć mięsień skroniowy na miejsce i zamknij miejsce nacięcia chirurgicznymi szwami z nylonu 5-0.
7. Przerwij znieczulenie i usuń sondę rektalną. Wstrzyknij myszy podskórnie drugą dawkę buprenorfiny (0.05mg/kg). Umieść mysz w klatce utrzymywanej w temperaturze 37°C za pomocą panelu grzewczego.
8. Przez następne 24 h uważnie monitoruj mysz pod kątem wystąpienia oznak dyskomfortu (zmniejszony apetyt/spożycie wody, przygarbiona postawa, przyspieszony oddech, zjeżona sierść). Wstrzykuj myszy buprenorfinę podskórnie co 3-5 h po operacji, aż do upływu 24h. W tym okresie zapewnij myszy dostęp do żelu regeneracyjnego.

3. Barwienie TTC i oznaczenie objętości zawału

1. Dwadzieścia cztery godziny po operacji mysz należy głęboko znieczulić, a następnie przeprowadzić perfuzję transkardialną przy użyciu mini pompy perystaltycznej z umiarkowaną prędkością przepływu, stosując 4% TTC (w/v) w buforze fosforanowym (PBS) przez 15 min, a następnie 4% roztwór paraformaldehydu przez 10 min. Mózg należy wyjąć i pozostawić w 4% roztworze paraformaldehydu na noc.
2. Mózg należy umieścić w bloku do sekcjonowania. Następnie, używając żyletek, wykonać skrawki mózgu o grubości 1 mm.
3. Skrawki należy ułożyć obok linijki milimetrowej. Dokumentację fotograficzną skrawków należy wykonać za pomocą aparatu cyfrowego podłączonego do mikroskopu sekcyjnego.
4. Powierzchnię obszaru udaru oblicza się, odejmując nieznieszkodowany obszar strony ipsilateralnej od całkowitej powierzchni strony kontralateralnej przy użyciu oprogramowania Image J (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Objętość udaru oblicza się poprzez sumowanie powierzchni udaru poszczególnych skrawków ²².

4. Instrukcje używania oprogramowania Image J

1. Otwórz plik obrazu przeznaczony do analizy w oprogramowaniu Image J, korzystając z menu pliku.
2. Wybierz narzędzie „straight line” (linia prosta) w programie. Narysuj linię prostą pomiędzy dwiema krawędziami na linijce. Kliknij menu „analyze” (analiza) i wybierz „set scale” (ustaw skalę). Wprowadź znaną odległość jako 1, a jednostkę długości jako mm.
3. Wybierz narzędzie „freehand circle” (okrąg rysowany odręcznie). Narysuj okrąg, aby obrysować przeciwległą półkulę. Kliknij menu „analyze” i wybierz „measure” (pomiar). Pojawi się okno z obliczeniami, wyświetlające pole powierzchni narysowanego okręgu.
4. Narysuj kolejny okrąg wokół półkuli ipsilateralnej, wykluczając obszar udaru (biały). Zmierz pole powierzchni zgodnie z instrukcją w punkcie 4.3. Nowa wartość zostanie dodana do okna obliczeń. Różnica między pierwszą a drugą wartością reprezentuje pole powierzchni zawału, oznaczone jako A w poniższym wzorze.
5. Oblicz pole powierzchni udaru w każdym przekroju, powtarzając kroki 4.2-4.4. Oblicz sumę pól powierzchni udaru wyliczonych w każdym przekroju (∑A_n). Reprezentuje to objętość udaru, przyjmując, że grubość każdego przekroju wynosi 1mm.
   ∑A_n x 1mm (grubość każdego przekroju) = Objętość udaru

5. Reprezentatywne wyniki:

Zawały uzyskane poprzez trwałe podwiązanie tętnicy środkowej mózgu (MCA) u myszy mają charakter głównie korowy. Możliwe jest jednak uzyskanie zmian podkorowych, jeśli podwiązanie MCA zostanie wykonane proksymalnie względem odgałęzień soczewicowo-prążkowiastych. Objętość zawału po podwiązaniu MCA może wynosić od 10mm³ do 35mm³ ^{19, 23}. Objętości zawałów obliczone na podstawie barwienia TTC w pracy Moyanova i wsp. ¹⁹ wynoszą od 10mm³ do 22mm³, podczas gdy objętości zawałów określone na podstawie obrazów MRI w pracy Filiano i wsp. ²³ mieszczą się w przedziale od 20mm³ do 35mm³. Możliwą przyczyną tych różnic może być dokładna lokalizacja podwiązania oraz zastosowanie różnych metod pomiaru objętości zawału.

Na rysunku 1 przedstawiono mózg myszy typu dzikiego C57/BL6 barwiony TTC 24 h po permanentnej ligacji MCA. Obszar udaru ma biały kolor (Rys. 1A, B). Rysunki 1A i B ilustrują miejsce zawału pod różnymi kątami. Rysunek 2 przedstawia plastry mózgu po udarze o grubości 1mm, barwione TTC, od części przedniej do tylnej (Rys. 2A-G). Objętość zawału obliczono 24 h po operacji. Objętość zawału wynosi ˜23mm³.

Rysunek 1. Przedstawienie miejsca udaru. A-B, obrazy całego mózgu barwione TTC, 24 h po ligacji MCA. Biały obszar reprezentuje obszar zawału.

Rysunek 2. Reprezentatywne wyniki. (A>G), barwione TTC przekroje mózgu o grubości 1mm, 24 h po MCAL. Przekroje są ułożone od przedniej do tylnej części. Biały obszar reprezentuje obszar zawału.

Dyskusja

Metoda trwałego podwiązania tętnicy środkowej mózgu (MCA) zapewnia wysoką powtarzalność objętości zawałów oraz zwiększone wskaźniki przeżywalności pooperacyjnej w porównaniu z innymi dostępnymi metodami. Prostota i krótki czas trwania procedury (˜30 min) czynią ją jeszcze bardziej praktyczną. Metoda ta jest szeroko stosowana zarówno u myszy, jak i u szczurów.

Technika ta wymaga inwazyjnego zabiegu chirurgicznego pod stereomikroskopem. Dlatego niezbędne jest doświadczenie w operowaniu pod mikro...