Dwuwymiarowa elektroforeza w żelu poliakrylamidowym: technika rozdzielania do analizy białek w złożonej mieszaninie białek na podstawie ładunku i masy cząsteczkowej

Streszczenie

Źródło: Zhan, X., et al. Dwuwymiarowa elektroforeza żelowa sprzężona z metodami spektrometrii mas do analizy proteomu tkanki gruczolaka przysadki ludzkiej J. Vis. Exp. (2018)

W tym filmie demonstrujemy dwuwymiarową metodę elektroforezy żelowej, która oddziela pojedyncze białka od złożonej mieszaniny białek uzyskanej z tkanek nowotworowych ludzkiego niefunkcjonalnego gruczolaka przysadki (NFPA). Białka są rozdzielane na podstawie ich ładunku elektrycznego w pierwszym wymiarze i dalej rozdzielane na podstawie mas cząsteczkowych w drugim wymiarze.

Protokół

1. Przygotowanie próbek

1. Pobrać tkanki gruczolaka przysadki (0,2 - 0,5 mg) z oddziału neurochirurgicznego. Natychmiast zamrozić w ciekłym azocie, a następnie przenieść do -80 °C w celu przechowywania.
2. Dodaj 2 ml 0,9% NaCl do dejonizowanej wody destylowanej (ddH₂O). Użyj tego roztworu, aby delikatnie zmyć krew z powierzchni tkanki (3x).
   NOTE: ddH₂O o przewodności 18,2 MΩ/cm jest stosowany w całym protokole. Część tkanki może zostać utracona podczas zmywania krwi z powierzchni tkanki.
3. Dodać objętość (10 ml; 4 °C) roztworu zawierającego 2 M kwas octowy i 0,1% (v/v) β-merkaptoetanolu na każde 0,5 - 0,6 g tkanki, homogenizować (1 min, 13 000 obr./min, 4 °C, 10x) za pomocą homogenizatora tkankowego, sonikować homogenat przez 20 s, liofilizować i przechowywać w temperaturze -80 °C.
4. Zmierzyć zawartość białka w liofilizowanych, homogenizowanych próbkach za pomocą zestawu do oznaczania kwasu bicinchoninowego (BCA).
   nuta: Kwantyfikacja BCA nie jest kwantyfikacją bezwzględną, a zmierzony wynik zostanie zmieniony przez innego technika i czynnik eksperymentalny. Do różnych doświadczeń należy stosować wzorzec próbki o stałym stężeniu. W związku z tym ostateczna ilość białek dla każdego żelu 2D zostanie określona za pomocą obrazu o dobrej rozdzielczości zabarwionego srebrem lub Coomassie w wcześniej zaprojektowanych eksperymentach.
   1. Dodać około 300 μg liofilizowanej homogenizowanej próbki do jednej objętości (282 μl) buforu do ekstrakcji białek (8 M mocznika i 4% CHAPS), a następnie odstawić na 2 godziny, sonikować w łaźni wodnej przez 5 minut, obracać przez 1 h, ponownie sonikować w łaźni wodnej przez 5 minut, ponownie obracać przez 1 godzinę, i odwirować przy 15 000 x g przez 20 min.
   2. Przygotować roztwory wzorcowe BSA o stężeniach, jak wspomniano: 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1,500, 2,000 μg/ml z dostępnym na rynku wzorcem BSA (2 mg/ml).
   3. Przed użyciem zmieszać odczynnik BCA A i B (A:B = 50:1) jako roztwór roboczy BCA.
   4. Dodać 0,1 ml próbki lub roztworu wzorcowego do 2 ml roztworu roboczego BCA w probówce do mikrofuge, następnie wymieszać, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Na koniec schłodzić w temperaturze pokojowej przez 10 minut i zmierzyć wartość średnicy zewnętrznej_{562 nm}.
   5. Obliczyć standardową linię liniową (A_{562 nm} w funkcji stężenia BSA), aby uzyskać równanie regresji do obliczenia zawartości białka w próbce o wartości A_{562 nm}.
5. Użyć 150 μg liofilizowanej próbki równoważnej białku do barwienia srebrem lub 500 μg białka do barwienia Coomassie, aby uzyskać 18-centymetrowy pasek o unieruchomionym gradiencie pH (IPG) pH 3-10 nieliniowy (NL).
   nuta: Suchy pasek IPG ma grubość 0,5 mm i szerokość 3 mm, różne długości, w tym 7, 11, 13, 18 i 24 cm, oraz różne zakresy pH, w tym pH 4-5, 4-7, 6-9 i 3-10 w liniowym lub nieliniowym gradieniu pH. Zastosowany bufor IPG musi pasować do paska.
6. Dodać 250 μl buforu ekstrakcyjnego (7 M mocznika, 2 M tiomocznik, 4% (w/v) CHAPS, 100 mM DTT (dodać przed użyciem), 0,5% v/v pharmalyte (dodać przed użyciem) i śladowe ilości błękitu bromofenolowego).
7. Utrzymuj roztwór w temperaturze poniżej 30 °C, następnie wiruj przez 5 minut, sonikuj przez 5 minut i obracaj przez 50 minut.
8. Dodać 110 μl buforu nawadniającego (7 M mocznika, 2 M tiomocznik, 4% (w/v) CHAPS, 60 mM DTT (dodać przed użyciem), 0,5% v/v buforu IPG (dodać przed użyciem) i śladowe ilości błękitu bromofenolowego). Sonikacja przez 5 minut. Następnie obracać próbkę przez 50 minut, wirować przez 5 minut i wirować przez 20 minut przy 15 000 x g.
9. Zebrać supernatant (350 μl) jako roztwór próbki białka.

2. Dwuwymiarowa elektroforeza żelowa

1. IEF (Pierwszy wymiar): Wykonaj IEF na izoelektrycznym systemie ogniskowania, jak opisano poniżej.
   1. Dodać 350 μl roztworu próbki białka do szczeliny w 18-centymetrowym uchwycie na paski IPG.
   2. Umieść 18-centymetrowy pasek IPG żelową stroną do dołu na roztwór próbki białka (unikaj pęcherzyków).
   3. Dodaj 3-4 ml oleju mineralnego, aby przykryć pasek IPG.
   4. Zamontuj uchwyt paska IPG w izoelektrycznym układzie ustawiania ostrości ze spiczastym końcem na tylnej (+) płytce i kwadratowym końcem na przedniej (−) płytce.
   5. Nawodnij się przez noc (~18 h w temperaturze pokojowej).
   6. Ustaw parametry IEF: maksymalny prąd 30 μA na listwę, 20 °C; 250 V, 1 h, 125 Vh, step and hold; 1 000 V, 1 h, 500 Vh, gradient; 8 000 V, 1 h, 4 000 Vh, gradient; 8 000 V, 4 h, 32 000 Vh, step and hold; oraz 500 V, 0,5 h, 250 Vh, step and hold. Niech działa do całkowitego czasu 7,5 godziny i 36 875 Vh.
   7. Po IEF wyjmij każdy pasek IPG i usuń nadmiar oleju mineralnego nierozpuszczalnym ręcznikiem papierowym. Teraz zawiń pasek w arkusz folii i przechowuj w temperaturze -80 °C.
      nuta: Uchwyt paska IPG należy wyczyścić roztworem czyszczącym uchwytu paska IPG i wodą destylowaną.
2. SDS-PAGE (Drugi wymiar): Wykonaj SDS-PAGE w pionowym systemie elektroforezy komórkowej
   nuta: Każdy rozmiar żelu SDS-PAGE powinien wynosić 255 x 190 x 1 mm.
   1. Użyj wielożelowego kółka, aby odlać żele rozdzielcze 12% PAGE. W przypadku odlewania żeli 12% PAGE należy wykonać następujące czynności.
      1. Dodać 270 ml ddH₂O, 150 ml 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 180 ml 40% (m/v) roztworu podstawowego akrylamidu/bisakryloamidu (29:1, 40% w/v akrylamidu i 1,38% w/v N, N'-metylenobisakryloamidu), 3 ml 10% nadsiarczanu amonu i 150 μl TEMED, aby uzyskać roztwór żelu w zlewce. Delikatnie wymieszaj i unikaj bąbelków.
      2. Delikatnie wlać roztwór żelu do komory multicastingu do oczekiwanej wysokości żelu (19 cm).
      3. Natychmiast dodaj około 3 ml ddH₂O na każdy żel rozdzielczy, aby pokryć żele. Pozostaw żel do polimeryzacji przez około 1 godzinę.
   2. Przygotuj 20 l buforu do elektroforezy (25 mM Tris, 192 mM gliceryny i 0,1% SDS). Napełnij zbiornik buforowy jednostki separacji elektroforezy tym buforem.
   3. Wyjmij skoncentrowane paski IPG z zamrażarki i równoważ paski przez 10 minut, delikatnie kołysząc w 4 ml redukującego buforu równowagi (375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 6 M mocznika, 2% (w/v) SDS, 20% (v/v) glicerol, 2% w/v DTT (dodać przed użyciem) i śladowe ilości błękitu bromofenolowego).
   4. Równoważyć przez 10 minut, delikatnie kołysząc zredukowanymi paskami IPG w 4 ml buforu równowagi alkilacyjnej (375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 6 M mocznika, 2% (w/v) SDS, 20% (v/v) glicerol, 2,5% w/v jodoacetamidu (dodać przed użyciem) i śladowe ilości błękitu bromofenolowego).
   5. Podczas równowagi żelu zdemontuj komorę multicastingu i wyjmij przygotowaną kasetę z żelem rozdzielczym. Spłucz 3x ddH₂O. Usuń nadmiar ddH₂O nierozpuszczalnym ręcznikiem papierowym i włóż do stojaka na żel.
   6. Wypłucz zrównoważone paski IPG buforem do elektroforezy i usuń nadmiar płynu z powierzchni paska IPG za pomocą nierozpuszczalnego ręcznika papierowego.
   7. Umieść pasek IPG na rozdzielczym żelu SDS-PAGE i pozwól, aby plastikowa strona paska IPG zetknęła się z dłuższą szklaną płytką i spiczastym końcem po lewej stronie.
   8. Wlej szybko 3-4 ml gorącej 1% agarozy do buforu do elektroforezy SDS (~80 °C), aby uszczelnić pasek IPG na wierzchu każdego żelu SDS-PAGE i połóż górną stronę paska IPG na górze krótszej szklanej płytki bez pęcherzyków, a następnie polimeryzuj przez 10 minut.
   9. Włóż zmontowaną kasetę żelową pionowo między plastikowe uszczelki w pionowym systemie elektroforezy. Umieść górną część żelu z paskiem IPG obok katody (−).
   10. Dostosuj poziom bufora do elektroforezy, aby zanurzyć kasetę z żelem.
   11. Podłącz i ustaw zasilacz/jednostkę sterującą w trybie stałego napięcia i pracuj pod napięciem 200 V przez około 370 minut, monitorując barwnik.
   12. Po uruchomieniu wyjmij kasetę z żelem z systemu elektroforezy i delikatnie wyjmij żel z kasety żelowej, unikając rozerwania żelu, a następnie zabarwienia białek oddzielonych od 2DE.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ettan IPGphor 3	GE Opieka zdrowotna		Izoelektryczny system ustawiania ostrości.
System Ettan DALT II	Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, Stany Zjednoczone		Pionowy system elektroforezy
Uchwyt na paski Ettan IPGphor	Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, Stany Zjednoczone
Ettan DALTsix multigel caster	Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, Stany Zjednoczone		Kółko Multigel
KimWipe (Czyszczenie Systemu)	Kimvipe powiedział:		Nierozpuszczalny ręcznik papierowy
Woda	Wykonane przez instrument PURELAB flex
Homogenizator Polytron Model P710/35	Brinkmann Instruments, Westbury, Nowy Jork
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 23227
Zestaw 2-D Quant	GE Opieka zdrowotna	80-6483-56
BIS-AKRYLAMID	AMRESCO (Morze Śródziemne)	Numer katalogowy: 0172
AKRYLAMID	AMRESCO (Morze Śródziemne)	0341
Naziemna telewizja	Sigma-Aldrich	D0632
Tiomocznik	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T8656
mocznik	VETEC (Międzynarodowa Federacja Weterynaryjn	V900119
Sds	AMRESCO (Morze Śródziemne)	Numer katalogowy: 0227
Żuchwy	AMRESCO (Morze Śródziemne)	Numer katalogowy: 0465
TEMED	AMRESCO (Morze Śródziemne)	Zobacz materiał M146
Nadsiarczan amonu	AMRESCO (Morze Śródziemne)	Zobacz materiał M133
Bufor IPG pH 3-10, NL	GE Opieka zdrowotna	Numer katalogowy: 17-6000-87
Immobiline Dry Strip pH 3-10NL, 18cm	GE Opieka zdrowotna	17-1235-01