1. Ładowanie i uruchamianie żelu
- Wszystkie próbki muszą być odpowiednio przygotowane, aby utrzymać funkcję enzymów i wykorzystane natychmiast po pobraniu lub przechowywane w stanie zamrożonym w temperaturze -80 °C. Próbki nie mogą zawierać środków redukujących (takich jak β-merkaptoetanol) ani nie mogą być gotowane przed załadowaniem żelem.
- Otwórz saszetkę zawierającą żel wewnątrz kasety, przepłucz kasetę wodą dejonizowaną.
- Usuń taśmę ochronną z dolnej części kasety i grzebień z górnej części żelu.
- Przepłukać studzienki trzykrotnie działającym buforem (rozcieńczonym do 1X w wodzie dejonizowanej).
- Umieść żel w Mini-Cell, upewniając się, że mniejsza strona kasety jest skierowana do wewnątrz. Zablokuj na miejscu za pomocą żelowego klina napinającego. Mini-Cell pozwala na równoległe prowadzenie jednego lub dwóch żeli.
- Napełnij górną (wewnętrzną) komorę buforem 1X biegnącym powyżej poziomu studni, sprawdź, czy nie ma wycieków. W przypadku nieszczelności należy usunąć bufor i ponownie umieścić żel.
- Napełnij dolną komorę buforem roboczym 1X.
- Załaduj 10 μl markera molekularnego białka do jednego dołka.
- Wymieszać równą ilość buforu ładującego żel i próbki, a następnie załadować do studzienek żelu za pomocą końcówek do ładowania żelu (zmienianych między każdą próbką). Studzienki te można załadować łącznie do 20 μl.
- Załóż pokrywę na Mini-Cell i podłącz przewody elektrod do zasilania. Włącz zasilanie i ustaw je tak, aby działało na stałym napięciu 125 V przez 90 minut. Sprawdź tworzenie się małych pęcherzyków na drucie dolnej komory, wskazujących na cyrkulację prądu.
- Podczas uruchamiania pierwszego żelu monitoruj postęp migracji co 15 minut, używając jako wskaźnika błękitu bromofenolowego zawartego w buforze ładującym. Pozwól żelowi działać, aż barwnik wskaźnikowy dotrze do dna żelu.
2. Odnawianie i rozwijanie żelu
- Dla każdego żelu przygotuj 100 ml buforu renaturyzującego 1X i 200 ml buforu denaturującego, oba w wodzie dejonizowanej.
- Gdy niebieski barwnik tropiący bromofenol dotrze do dna żelu, wyłącz zasilanie, otwórz Mini-Cell i usuń żel. Oddziel dwie strony kasety za pomocą noża do żelu (lub szpatułki do ważenia). Wytnij róg, aby zaznaczyć kierunek żelu.
- Ostrożnie wyjąć żel z kasety i umieścić w pojemniku ze 100 ml buforu do renaturyzacji. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
- Usunąć bufor do renaturyzacji i dodać do żelu 100 ml buforu rozwijającego. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
- Usunąć bufor rozwijający i dodać do żelu 100 ml więcej buforu rozwijającego. Inkubować przez noc (16-18 godzin) w temperaturze 37°C.
- Usunąć rozwijający się bufor i spłukać trzy razy (po 5 minut) wodą dejonizowaną pod delikatnym mieszaniem w temperaturze pokojowej.
- Zeskanuj żel, aby zapisać dokładne położenie standardowych pasm białkowych, ponieważ po barwieniu żelem staną się one mniej widoczne lub nie będą widoczne.
- Zabarwić żel, dodając do niego 20 ml SimplyBlue Safestain. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej pod delikatnym mieszaniem.
- Usuń SimplyBlue SafeStain i odplam żel w 100 ml lub więcej dejonizowanej wodzie przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej pod delikatnym mieszaniem.
- Aby uzyskać lepsze wyniki, zastąp świeżą wodą dejonizowaną i inkubuj przez kolejną godzinę lub dłużej w temperaturze pokojowej pod delikatnym mieszaniem.
