$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Funkcjonalizacja tablicy za pomocą biotynylowanego przeciwciała
- Przygotuj następujące rozwiązania.
- Bufor T50, roztwór 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) i 50 mM NaCl. Roztwór jest stabilny przez 1 miesiąc w RT.
- T50-BSA poprzez uzupełnienie buforu T50 o 0,1 mg/ml BSA. Przygotowany roztwór należy przechowywać na lodzie.
- 10 mg/ml borowodorku sodu (NaBH4) w 1x PBS. Przygotuj to bezpośrednio przed użyciem.
- 0,2 mg/ml NeutrAwidyny (patrz Tabela Materiałów) w buforze T50.
ostrożność: NaBH4 jest środkiem redukującym i jest łatwopalny. Po użyciu należy zawsze przepłukać pojemnik azotem gazowym i przechowywać go w eksykatorze.
- Funkcjonalizować macierz za pomocą biotynylowanego przeciwciała.
- Wyjmij z zamrażarki matryce funkcjonalizowane PEG-biotyną i zrównoważ stożkową rurkę z RT przed otwarciem. Umieścić szkiełko nakrywkowe z matrycą skierowaną do góry na wyłożonym folią uszczelniającą naczyniu do hodowli tkankowych o średnicy 100 mm (TC100).
nuta: Zminimalizuj oświetlenie górne. Wszystkie roztwory powinny "perplać się" na kwadratach zdefiniowanych przez układ hydrofobowy. Dodaj odpowiednią objętość roztworu, aby całkowicie pokryć każdy kwadrat (zwykle 10-15 μl) i nie pozwól, aby płyn przelał się przez wyznaczoną przestrzeń. Aby szybko usunąć płyny, użyj wewnętrznego przewodu próżniowego podłączonego do kolby próżniowej w celu wychwytywania odpadów. Pozwól NaBH4 odgazować się przez 1 godzinę przed usunięciem, pozostawiając rurkę otwartą w okapie oparów chemicznych. Leczenie NaBH4 jest konieczne w celu zmniejszenia autofluorescencji tła, zmniejszając w ten sposób liczbę fałszywie dodatnich wykryć pojedynczych cząsteczek.
- Potraktuj każdy kwadrat tablicy 10 mg/ml NaBH4 w 1x PBS przez 4 minuty w temperaturze pokojowej. Przemyć trzykrotnie PBS.
- Inkubować każdy kwadrat przez 5 minut z 0,2 mg/ml NeutrAwidyny w T50. Umyć trzykrotnie T50-BSA.
nuta: NeutrAwidyna wiąże się z PEG-biotyną i stanowi miejsce wiązania dla przeciwciał biotynylowanych.
- Inkubować każdy kwadrat przez 10 minut z 2 μg/ml biotynylowanego przeciwciała specyficznego dla POI w T50-BSA; przemyć trzykrotnie T50-BSA.
nuta: Niniejszy protokół wykorzystuje biotynylowane anty-EGFR IgG (patrz tabela materiałów) do wychwytywania EGFR-GFP.
2. SiMPull POI z lizatów całokomórkowych
UWAGA: Umieść naczynie TC100 z funkcjonalizowanymi tablicami SiMPull na lodzie na resztę przygotowania SiMpull. Ten krok polega na pobraniu POI z całkowitego lizatu białkowego. Lizat nie może być ponownie użyty po rozmrożeniu.
- Przygotuj następujące rozwiązania.
- Przygotować 4% paraformaldehydu (PFA)/0,1% aldehydu glutarowego (GA) w 1x PBS.
ostrożność: PFA i GA są toksycznymi utrwalaczami chemicznymi i potencjalnymi czynnikami rakotwórczymi. Nosić środki ochrony osobistej. Chemikalia należy utylizować jako odpady niebezpieczne zgodnie z lokalnymi przepisami i wytycznymi.
- Przygotuj 10 mM Tris-HCl, pH 7,4.
- Rozmrozić i wymieszać lizat, delikatnie pipetując w górę iw dół. Trzymaj na lodzie.
- Rozcieńczyć 1 μl lizatu w 100 μl lodowatego T50-BSA/PPI.
nuta: W razie potrzeby należy określić odpowiedni współczynnik rozcieńczenia całkowitego lizatu białkowego, stosując szereg rozcieńczeń do matrycy. Optymalna gęstość receptorów SiMPull na powierzchnię matrycy wynosi 0,04-0,08/μm2.
- Inkubować lizat na matrycy przez 10 minut, a następnie przemyć czterokrotnie lodowatym roztworem T50-BSA/PPI.
- Rozcieńczyć przeciwciało antyfosfotyrozynowe sprzężone z AF647 (patrz tabela materiałów) w lodowatym T50-BSA/PPI i inkubować na matrycy przez 1 h.
nuta: W niniejszym protokole do identyfikacji fosforylowanej populacji EGFR-GFP stosuje się pan-anty-pTyr (PY99)-AF647 IgG. Zastosowanie przeciwciał znakowanych bezpośrednio eliminuje potrzebę stosowania przeciwciał drugorzędowych, zwiększając możliwości znakowania i poprawiając spójność wyników. Przeciwciała znakowane fluorescencyjnie można uzyskać ze źródeł komercyjnych. Jeśli nie są dostępne na rynku, przeciwciała mogą być znakowane na zamówienie przy użyciu standardowych technik biokoniugacji, a dostępne są komercyjne zestawy do biokoniugacji. Każda partia przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie musi zostać przetestowana pod kątem optymalnych warunków znakowania poprzez wykonanie SiMPull w celu zmierzenia krzywej dawki i znalezienia punktu nasycenia.
- Umyj sześć razy lodowatym T50-BSA, w sumie przez 6-8 minut.
- Umyć dwukrotnie lodowatym środkiem 1x PBS.
- Inkubować macierz z 4% roztworem PFA/0,1% GA przez 10 minut, aby zapobiec dysocjacji przeciwciał.
- Przemyć dwukrotnie przez 5 minut za pomocą 10 mM Tris-HCl, pH 7,4/PBS w celu dezaktywacji utrwalaczy.
nuta: W przypadku eksperymentów z użyciem więcej niż jednego przeciwciała (np. wykrywanie wielu miejsc fosfotyrozyny) powtórz kroki 2.5-2.9.
3. Akwizycja obrazu
UWAGA: Akwizycja obrazu pojedynczej cząsteczki odbywa się za pomocą obiektywu TIRF 150x i rozdzielacza obrazu, który przechwytuje każdy kanał widmowy w określonym kwadrancie kamery emCCD (zobacz Tabelę materiałów). Obrazy kalibracyjne są najpierw pozyskiwane, aby umożliwić rejestrację kanałów i kalibrację wzmocnienia kamery za pomocą siatki wyrównania kanałów z nanowzorcem (nanogrid), która zawiera 20 x 20 tablic otworów o długości fali 200 ± 50 nm w odległości od 3 ± 1 μm (całkowity rozmiar ~60 μm × 60 μm).
- Dokonaj rejestracji kanału, wykonując poniższe czynności.
nuta: Dokładna rejestracja kanałów jest potrzebna do prawidłowego obliczenia kolokalizacji emiterów. Ten krok ma kluczowe znaczenie.
- Wyczyść tarczę olejową i nałóż na nią kroplę oleju. Umieść nanosiatkę na stoliku w celu obrazowania. Korzystając z przechodzącego białego światła, skoncentruj się na wzorze siatki.
nuta: Obrazy za pomocą nanosiatki są pozyskiwane za pomocą światła przechodzącego, które przechodzi przez nanosiatkę i jest wykrywane we wszystkich kanałach widmowych. Alternatywnie można użyć kulek multifluorescencyjnych, które emitują fluorescencję wykrytą w każdym kanale. Akwizycja obrazu będzie musiała być zoptymalizowana zgodnie z każdą konfiguracją mikroskopu.
- Zrób serię 20 obrazów siatki. Upewnij się, że piksele nie są nasycone. Zapisz serię obrazów jako "Wierny".
- Rozogniskuj nanosiatkę, aby utworzyć wzór Airy. Wykonaj serię 20 obrazów w celu kalibracji wzmocnienia. Zapisz obraz jako "Wzmocnienie".
- Uzyskaj serię 20 obrazów do przesunięcia kamery, blokując całe światło przed dotarciem do aparatu. Zapisz obraz jako "Tło".
- Pobierz SiMPull images.
nuta: Przed obrazowaniem układu szkiełek nakrywkowych należy wymienić roztwór Tris na T50-BSA i zrównoważyć układ do RT.
- Wyczyść obiektyw olejowy i nałóż na niego dodatkową ilość oleju. Zamocuj matrycę szkiełek nakrywkowych na stoliku mikroskopu.
- Zoptymalizuj moc wzbudzenia każdego fluoroforu, kąt TIRF i czas integracji kamery. Celem jest osiągnięcie najwyższego stosunku sygnału do szumu przy jednoczesnej minimalizacji fotowybielania próbki. Zapisz moc lasera, aby zachować spójność w przyszłych pomiarach.
nuta: W niniejszym badaniu wykorzystano czas ekspozycji 300 ms dla kanału dalekiej czerwieni i 1 s dla kanału zielonego. Zastosowano laser o długości fali 642 nm o mocy około 500 μW, natomiast laser o długości fali 488 nm o mocy 860 μW, mierzonej przed soczewką tuby.
- Uzyskaj obrazy dla każdej próbki. Najpierw zobrazuj kanał dalekiej czerwieni, a następnie każdy fluorofor o niższej długości fali, aby zmniejszyć fotowybielanie. Ze względu na małą objętość używaną do każdej próbki, sprawdzaj poziom buforu co 30-45 minut i uzupełniaj w razie potrzeby.