$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Płaskie dwuwarstwy lipidowe
- Czyszczenie plazmowe szkiełek
nuta: Czyszczenie plazmowe usuwa zanieczyszczenia organiczne i zwiększa hydrofilowość szkła, zapewniając wydajną adsorpcję lipidów. Poniższe kroki mogą ulec zmianie lub wymagać optymalizacji w zależności od użytego środka do czyszczenia plazmowego i szklanych szkiełek nakrywkowych.
- Płucz myjkę plazmową przez 5 minut tlenem, aby usunąć powietrze z przewodów i komory. Ma to na celu zapewnienie, że podczas pracy czyszczalni plazmowej w przewodach i komorze znajduje się głównie tlen, co zapewnia bardziej spójne przygotowanie dwuwarstwowe.
- Podczas przedmuchiwania rozpylaj gaz obojętny, taki jak N2 lub Ar, na szkiełka z mikro pokrywą, aby usunąć kurz i cząstki stałe.
fakultatywny: Szkiełka nakrywkowe można myć, spryskując z każdej strony 100% izopropanolem, a następnie wodą. Powtórzyć płukanie izopropanolem z wodą 3x, a następnie wysuszyć strumieniemN2.
- Ułóż suche szkiełka nakrywkowe w ceramicznej kołysce. Umieść kołyskę z tyłu komory plazmowej tak, aby szkiełka nakrywkowe były równoległe do dłuższej krawędzi komory (dzięki temu pozostaną na miejscu podczas czyszczenia plazmowego). Uruchom myjkę plazmową na 15 minut z tlenem o maksymalnej mocy.
- Przygotowanie komory
nuta: Opisana tutaj metoda wykorzystuje domowe komory z plastikowych probówek PCR do podtrzymywania objętości reakcji, ale odpowiednie mogą być również inne materiały o niskiej przyczepności, takie jak studzienki silikonowe.
- Za pomocą żyletki lub nożyczek odetnij nakrętkę tuż pod matową częścią probówki PCR o pojemności 0,2 ml (ryc. 1).
- Pomaluj krawędź probówki PCR klejem aktywowanym promieniami UV, omijając wnętrze probówki. Delikatnie umieść klej w tubce PCR na środku szkiełka nakrywkowego oczyszczonego plazmowo.
nuta: Aby uniknąć przedostania się kleju do wnętrza komory, użyj minimalnej ilości kleju, aby uzyskać uszczelnienie, i natychmiast potraktuj promieniami UV bez uderzania lub naruszania komory.
- Umieść komorę pod światłem UV o dużej długości fali na 5-7 minut, aby utwardzić klej.
- Formacja dwuwarstwowa
nuta: Na tym etapie należy zastosować monorozproszone SUV-y w celu wydajnego tworzenia dwuwarstwowego. Tabela 1 zawiera receptury dla wszystkich stosowanych w tworzeniu dwuwarstwowym, w tym stężenia podstawowe i końcowe stężenia buforowe.
- Dodać 40 μl wspieranego dwuwarstwowego buforu lipidowego (SLBB: 300 mM KCl, 20 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM MgCl2; Tabela 1), 10 μl 5 mM SUV i 1 μL 100 mM CaCl2 do studzienki. Delikatnie potrząsać komorami z boku na bok, aby rozerwać działanie SUV-ów, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 min.
nuta: Aby ograniczyć parowanie, inkubować na przykrytej szalce Petriego wilgotną chusteczką.
- Wypłukiwanie nadmiaru lipidów
nuta: Ten krok usuwa nadmiar SUV-ów i działa jako etap wymiany bufora. Bardzo ważne jest, aby podczas mycia nie skrobać dwuwarstwy końcówką pipety; Jeśli szkło zostanie odsłonięte, septyny i wiele innych białek zwiążą się nieodwracalnie, zmniejszając efektywne stężenie białka.
- Po inkubacji przepłukać dwuwarstwę 6x 150 μl SLBB, pipetując w górę i w dół, aby za każdym razem wymieszać, unikając pęcherzyków.
UWAGA: Dodać 150 μl bezpośrednio do 50 μl buforu i SUV już obecnych, co daje w sumie 200 μl w basenie reakcyjnym.
- Gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia inkubacji z septynami lub innym wybranym białkiem, przemyj dwuwarstwę 6x 150 μl buforu reakcyjnego (RXN: 33,3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4, 1,4 mg/ml BSA, 0,14% metylocelulozy, 1 mM BME).
UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy przygotować świeży bufor reakcyjny i zachować szczególną ostrożność podczas dobrego mieszania w reakcji, aby uniknąć pęcherzyków.
- Na ostatnim etapie płukania usunąć 125 μl buforu reakcyjnego, pozostawiając 75 μl w studzience. Dodać 25 μl septyny rozcieńczonej w buforze do przechowywania septyny (SSB: 300 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM BME) w żądanym stężeniu i obrazować za pomocą mikroskopii TIRF.
nuta: Podczas ustawiania tego testu po raz pierwszy lub wprowadzania nowego składu lipidowego dobrą praktyką jest zapewnienie swobodnej dyfuzji lipidów na powierzchni za pomocą odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP). Chociaż tempo odzysku będzie różne dla różnych składów lipidowych i z natury niższe niż w przypadku systemów wolnostojących, lipidy nie powinny być unieruchomione.
Tabela 1: Składniki buforowe do przygotowania wspieranej dwuwarstwy lipidowej i reakcji. Pokazane są objętości roztworów podstawowych, które są włączone do, oraz końcowe stężenia każdego składnika. SLB i PRB mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej i ponownie wykorzystywane między eksperymentami. Bufor reakcyjny i SSB są odnawiane dla każdego eksperymentu.
| Obsługiwany dwuwarstwowy bufor lipidowy (SLBB) |
| skład | głośność | Końcowe stężenie |
| 2 mln KCl | 1,5 ml | 300 mM |
| 1 M SZYBY | 200 μL | 20 mM |
| 500 mM MgCl2 | 20 μL | 1 mM |
| Woda | 8 ml | |
| Bufor przed reakcją (PRB) |
| skład | głośność | Końcowe stężenie |
| 2 mln KCl | 166 μL | 33,3 mln |
| 1 M SZYBY | 500 μL | 50 mM |
| Woda | 9,33 ml | |
| Bufor reakcyjny |
| skład | głośność | Końcowe stężenie |
| 2 mln KCl | 166 μL | 33,3 mln |
| 1 M SZYBY | 300 μL | 50 mM |
| 10 mg/ml masy ciała | 1,39 ml | 1,39 mg/ml |
| 1% Metyloceluloza | 1,39 ml | 0,0014 |
| Woda | Do 10 ml | |
| Bme | 0,7 μl | 1 mM |
| Septin Bufor pamięci masowej (SSB) |
| skład | głośność | Końcowe stężenie |
| 2 mln KCl | 1,5 ml | 300 mM |
| 1 M SZYBY | 500 μL | 50 mM |
| Woda | Do 10 ml | |
| Bme | 0,7 μl | 1 mM |
