Test dwuwarstwowy lipidów ze sferycznym wsparciem: technika obserwacji składania się septyny na mikrosferach

Streszczenie

Źródło: Curtis, B. N. et al., Rekonstrukcja zespołu septyny w błonach w celu zbadania właściwości i funkcji biofizycznych. J. Vis. Exp. (2022).

Ten film opisuje technikę badania składania białek septyny na mikrosferach pokrytych dwuwarstwami lipidowymi. Technika ta pomaga w zrozumieniu zależnych od krzywizny zespołów białek na zakrzywionych powierzchniach.

Protokół

1. Sferyczne dwuwarstwy lipidowe

UWAGA: Ten protokół wykorzystuje mikrosfery krzemionkowe zawieszone w ultraczystej wodzie o gęstości 10%. W przypadku wszelkich prac nad parametrami kinetycznymi składania białek ważne jest ścisłe kontrolowanie całkowitej powierzchni błony między eksperymentami a krzywiznami. Tabela 1 przedstawia skorygowane objętości kulek i bufora w celu utrzymania 5^mm2 całkowitej powierzchni błony.

1. Formacja dwuwarstwowa
   nuta: Jeśli chodzi o dwuwarstwy płaskie, ważne jest, aby mieć wysokiej jakości SUV-y do solidnego tworzenia dwuwarstw. W tabeli 1 wymieniono objętość ściegów z roztworu o gęstości 10% i odpowiadające im objętości SLBB, które są używane do uzyskania końcowej powierzchni 5^mm2 dla różnych średnic ściegów.
   1. Mikrosfery krzemionkowe (zwane również kulkami) mają tendencję do osiadania i zbijania się razem; aby wymieszać kulki i rozbić wszelkie skupiska, należy wirować butelkę przez 15 s, następnie kąpiel sonikacyjną przez 1 minutę i ponownie wirować przez 15 s.
   2. Wymieszać odpowiednią objętość kulek (Tabela 1) z odpowiednią objętością SLBB i 10 μl 5 mM SUV w probówce do mikrowirówek o niskiej przyczepności o pojemności 0,5 ml.
   3. Kołysz mieszaninę kulek i lipidów od końca do końca przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że ta inkubacja jest wykonywana na rotatorze, aby zapobiec sedymentacji.
2. Przygotować komory na pegylowanych szkiełkach nakrywkowych
   nuta: Jeśli chodzi o dwuwarstwy płaskie, domowe komory z plastikowych probówek PCR są używane do podtrzymywania objętości reakcji, ale inne materiały o niskiej przyczepności, takie jak studzienki silikonowe, mogą działać równie dobrze.
   1. Podczas gdy koraliki się kołyszą, rozmrozić pegylowane szkiełko nakrywkowe w temperaturze pokojowej. Wytnij probówkę PCR o pojemności 0,2 ml i przyklej ją do szkiełka nakrywkowego zgodnie z opisem. W przypadku prowadnic 24 mm x 50 mm na jednej prowadnicy można zmieścić do 10 komór.
      nuta: W protokole tym wykorzystuje się szkiełka nakrywkowe ze szkła PEGylowanego o wymiarach 24 mm x 50 mm, które są przygotowywane z wyprzedzeniem. Krótko mówiąc, szkiełka nakrywkowe są dokładnie czyszczone poprzez sonikację w acetonie, metanolu i 3 M KOH. Szkiełka nakrywkowe są następnie funkcjonalizowane n-2-aminoetylo-3-aminopropylotrimetoksysilanem i kowalencyjnie łączone z walerianianem sukcynimidylu mPEG. Gotowe szkiełka nakrywkowe PEGylowane są przechowywane w zamknięciu próżniowym w temperaturze -80 °C. Chociaż sugerowane są tutaj szkiełka nakrywkowe ze szkła pegylowanego, skuteczne mogą być inne metody pasywacji, takie jak metody BSA lub poli-L-lizyny.
3. Wypłukiwanie nadmiaru lipidów
   nuta: Ten krok służy do usunięcia nadmiaru SUV-ów i przeprowadzenia wymiany bufora. Kulki są myte łącznie 4 razy buforem przedreakcyjnym (PRB: 33,3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4). W tabeli 2 wymieniono prędkości wirowania w RCF dla różnych średnic kulek.
   1. Wiruj koraliki w wyznaczonym RCF przez 30 s (Tabela 2). Jeśli używasz wielu rozmiarów koralików, utrzymuj koraliki na kołysaniu, aż nadejdzie czas na ich pranie.
      nuta: Nie warto sedymentować większych kulek w tym samym obrocie, co mniejszych kulek o mniejszej prędkości sedymentacji, aby zaoszczędzić czas. Może to spowodować przyklejanie się koralików do siebie i naruszenie integralności dwuwarstwy.
   2. Po pierwszym wirowaniu usunąć 50 μl supernatantu i dodać 200 μl PRB. Po drugim i trzecim wirowaniu usuń 200 μl i dodaj 200 μl PRB. Po czwartym wirowaniu usunąć 200 μl i dodać 220 μl PRB. Energicznie pipetować do każdego prania.
      nuta: Ostateczna objętość do ponownego zaparcia jest inna niż w przypadku płukania. Nie wiruj kulek po inkubacji z lipidami, ponieważ może to pozostawić luki w dwuwarstwach. Aby uniknąć sedymentacji podczas pracy z innymi rozmiarami ściegów lub ustawiania innych części testu, umieść mieszaniny kulek z powrotem na rotatorze od końca do końca.
4. Przygotowanie reakcji
   1. Jeśli wykonujesz test konkursowy z wieloma rozmiarami kulek, przygotuj mieszaninę 1:1, mieszając ze sobą równe objętości każdego rozmiaru kulki. Następnie wymieszaj 29 μl żądanej mieszaniny kulek (lub pojedynczej kulki) z 721 μl buforu RXN.
      nuta: Ważne jest, aby dokładnie wymieszać kulki na każdym etapie za pomocą pipety, aby uniknąć gęstych skupisk kulek; Spowoduje to bardziej równomierne rozłożenie ściegu i dokładną powierzchnię całkowitą.
   2. Zmieszać 75 μl rozcieńczonych kulek i 25 μl białka rozcieńczonego w SSB z dołkami.
      nuta: Autorzy zazwyczaj obrazują kompleksy septyny drożdży przy 1-50 nM.
   3. W przypadku pomiaru septyny w stanie stacjonarnym inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a następnie obrazować za pomocą mikroskopii bliskiej TIRF lub konfokalnej.
      nuta: Reakcja ta ma na celu zachowanie całkowitej powierzchni błony reakcji na poziomie 5^mm2 i uzyskanie końcowych warunków reakcji 100 mM KCl, 50 mM HEPES, 1 mg/ml BSA, 0,1% metylocelulozy i 1 mM BME.

Tabela 1: Znormalizowane objętości mikrosfer. W celu utrzymania równej powierzchni każdego rozmiaru kulki i utrzymania całkowitej powierzchni membrany na stałym poziomie między eksperymentami, obliczono objętości dla każdego rozmiaru koralika i bufora, który normalizował całkowitą powierzchnię.

pkt. pkt. TGL pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.

Średnica ściegu (μm)	Objętość dobrze wymieszanych kulek (μL)	Objętość buforu SLB (μL)	Objętość SUV-ów (μL)
Godzina 6,46	8,94	61,1	10
Norma 5,06	7	Rozdział 63	10
Pytanie 3,17	Godzina 4,39	65,6	10
0,96	1,33	68,7	10
0,54	0,75	69,3	10
0,31	0,43	69,6	10

Tabela 2: Prędkości sedymentacji dla mikrosfer o różnych średnicach. Dla każdej średnicy kulki, pokazane minimalne prędkości sedymentacji zostały użyte do granulowania kulek w celu wypłukania niezwiązanych liposomów

pkt. pkt. pkt. TGL

Średnica ściegu (μm)	Prędkość sedymentacji (RCF)
0,31	Rozdział 4.5
0,54	Rozdział 4.5
0,96	2.3
Pytanie 3,17	0,8
Norma 5,06	0,3

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówki PCR 0,2 ml z płaską nakrętką, naturalne	Watson	137-211C(DAWNIEJ)
Probówki 0,5 ml o niskiej przyczepności	USA Naukowe	1405-2600
Beta merkaptoetanol (BME)	Sigma-Aldrich	Silnik M6250-100ML
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	A4612-25G
Szkło nakrywkowe do produkcji szkiełek nakrywkowych PEGylowanych	Thermo Scientific	Numer katalogowy: 152450	Richard-Allan Scientific Szkło osłonowe SLIP-RITE 24x50 #1.5
DOPC (Protokół DOPC	Lipidy polarne Avanti	850375
Jajo Liss Rodamina PE	Lipidy polarne Avanti	810146
HEPESY	Sigma Aldrich	H3375-1KG
Metyloceluloza 4000cp	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M052-100G
Mini wirówka
Niefunkcjonalizowane mikrosfery krzemionkowe	Bangs Laboratories, Inc.	Zależy od rozmiaru: SS0200*-SS0500*	Krzemionka w zawiesinie wodnej
Klej optyczny	Tholabs z Norlandii	NOA 68	Elastyczny klej do szkła lub tworzyw sztucznych
Chlorek potasu	Firma VWR	0395-1kg
Kąpiel Sonicator	Branson	1510R-MT	Bransonic Myjka ultradźwiękowa. 50-60 Hz. Moc wyjściowa: 70W
Soja PI	Lipidy polarne Avanti	840044
Wirówka stołowa	Eppendorf	Numer katalogowy: 22331
Lampa UV	Spektrolina	ENF-260C	115 V, 60 Hz, 0,20 A

) powiedział: powiedział: