Method Article

Struktura zespołów kapsydów HIV-1 za pomocą mikroskopii krioelektronowej i iteracyjnej spiralnej rekonstrukcji w przestrzeni rzeczywistej

DOI:

10.3791/3041

⸱

August 9th, 2011

 ,  , 
1Department of Structural Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje metodę uzyskiwania trójwymiarowej (3D) struktury spiralnie złożonych cząsteczek za pomocą mikroskopii krioelektronowej. W tym protokole używamy zespołów kapsydu HIV-1 do zilustrowania szczegółowej procedury rekonstrukcji 3D w celu uzyskania mapy gęstości za pomocą iteracyjnej spiralnej metody rekonstrukcji w przestrzeni rzeczywistej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia krioelektronowa (cryo-EM), w połączeniu z przetwarzaniem obrazu, jest coraz potężniejszym narzędziem do określania struktury makromolekularnych kompleksów i zespołów białkowych. W rzeczywistości mikroskopia elektronowa pojedynczych cząstek1 i dwuwymiarowa (2D) krystalografia elektronowa2 stały się stosunkowo rutynowymi metodologiami i przy użyciu tych metod rozwiązano dużą liczbę struktur. W tym samym czasie szybko rozwinęło się przetwarzanie obrazów i trójwymiarowa (3D) rekonstrukcja obiektów helikalnych, w szczególności metoda iteracyjnej rekonstrukcji śrubowej w przestrzeni rzeczywistej (IHRSR)3, która wykorzystuje narzędzia do analizy pojedynczych cząstek w połączeniu z symetrią śrubową. Wiele jednostek biologicznych funkcjonuje w formach nitkowatych lub spiralnych, w tym filamenty aktynowe4, mikrotubule5, włókna amyloidowe 6, wirusy mozaiki tytoniu 7 i wici bakteryjne8, a ponieważ mapę gęstości 3D jednostki spiralnej można uzyskać z pojedynczego obrazu projekcyjnego, w porównaniu z wieloma obrazami wymaganymi do rekonstrukcji 3D obiektu niespiralnego, Dzięki metodzie IHRSR możliwa jest obecnie analiza statyczno-wytrzymałościowa takich elastycznych i nieuporządkowanych zespołów śrubowych.

W tym artykule wideo przedstawiamy szczegółowe protokoły uzyskiwania mapy gęstości 3D zespołu białek helikalnych (HIV-1 kapsyd9 jest naszym przykładem), w tym protokoły przygotowania próbek cryo-EM, zbierania danych o niskiej dawce przez cryo-EM, indeksowania spiralnych wzorów dyfrakcyjnych oraz przetwarzania obrazów i rekonstrukcji 3D za pomocą IHRSR. W porównaniu z innymi technikami, cryo-EM zapewnia optymalną konserwację próbek w warunkach zbliżonych do rodzimych. Próbki są osadzane w cienkiej warstwie szklistego lodu przez szybkie zamrażanie i obrazowane w mikroskopach elektronowych w temperaturze ciekłego azotu, w warunkach niskiej dawki, aby zminimalizować uszkodzenia spowodowane promieniowaniem. Przykładowe obrazy są uzyskiwane w warunkach zbliżonych do natywnych kosztem słabego sygnału i niskiego kontrastu na zarejestrowanych mikrofotografiach. Na szczęście proces rekonstrukcji spiralnej został w dużej mierze zautomatyzowany, z wyjątkiem indeksowania spiralnego wzoru dyfrakcyjnego. W tym miejscu opisujemy podejście do indeksowania struktury śrubowej i określania symetrii (parametrów spiralnych) na podstawie zdigitalizowanych mikrofotografii, co jest niezbędnym krokiem do rekonstrukcji spiralnej 3D. W skrócie wstępną mapę zagęszczenia 3D uzyskujemy stosując metodę IHRSR. To początkowe odwzorowanie jest następnie iteracyjnie udoskonalane przez wprowadzenie ograniczeń dla parametrów wyrównania każdego segmentu, kontrolując w ten sposób ich stopnie swobody. Dalszą poprawę uzyskuje się poprzez skorygowanie o funkcję przenoszenia kontrastu (CTF) mikroskopu elektronowego (korekcja amplitudy i fazy) oraz poprzez optymalizację symetrii śrubowej zespołu.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie mrożono-uwodnionej próbki EM

Ponieważ zespoły 9 białka kapsydu HIV-1 (CA) są stabilne tylko w buforze o wysokiej zawartości soli (1M NaCl), co przyczynia się do silnego szumu tła na obrazach krio-EM, używamy metody szybkiego rozcieńczania i blottingu z tyłu, aby przejściowo zmniejszyć stężenie soli podczas przygotowywania zamrożonej i uwodnionej siatki EM.

  1. Żar rozładowuje się po stronie węglowej miedzianych siatek R2/1 Quantifoil o oczkach 200 poniżej 25 mA przez 25 sekund.
  2. Użyj nebulizatora, aby doprowadzić wilgotność w komorze środowiskowej, domowym ręcznym tłoku grawitacyjnym, do 80%.
  3. W FEI Vitrobot Plunger dewar schłodzić ciekły etan za pomocą ciekłego azotu. Zamontuj dewara do zamrażania wgłębnego na ręcznym tłoku grawitacyjnym
    4. .
  4. Nałóż 2,5 μl wstępnie zmontowanego roztworu CA na węglową stronę siatki, która jest zamontowana na kleszczach, i załaduj kleszczyki na tłok tak, aby węglowa strona siatki była skierowana od siebie.
  5. Dodać 3 μl buforu do rozcieńczania o niskiej zawartości soli (100 mM NaCl) na tylną stronę kratki i natychmiast osuszyć tylną stronę siatki kawałkiem bibuły filtracyjnej. Cała tylna powierzchnia siatki powinna być w bliskim kontakcie z bibułą filtracyjną przez około 6 sekund, przed wyjęciem bibuły filtracyjnej. Po wyjęciu bibuły filtracyjnej natychmiast zanurz siatkę w ciekłym etanowym.
  6. Zdejmij kleszczyki z tłoka i szybko przenieś siatkę do skrzynki do przechowywania siatki.

2. Mikroskopia krioelektronowa zespołów rurowych CA

  1. Załaduj zamrożoną, uwodnioną siatkę do mikroskopu elektronowego FEI Polara G2 pracującego przy napięciu 200 kv i wyposażonego w kamerę CCD Gatan 4Kx4K.
  2. W trybie wyszukiwania przy niskiej dawce, przy powiększeniu ~200x i dawce <0,001e-/TΥ2, przesiewaj całą siatkę w poszukiwaniu obszarów z odpowiednim lodem i zapisz pozycje tych obszarów w pliku etapu.
  3. Przywołaj zapisane pozycje i dalej przesiewaj te obszary w powiększeniu 3,900x w trybie wyszukiwania z niską dawką. Wybierz obszary z jednolitą, cienką warstwą lodu zawierającą dobrze oddzielone, długie rurki nad otworami, do zbierania danych. Zapisz lokalizacje tych obszarów w pliku drugiego etapu.
  4. Przełącz się w tryb ekspozycji przy powiększeniu 59 000x, wstaw aperturę obiektywu 100 μm i dostosuj stygmatyzm obiektywu i intensywność wiązki dla dawki ̃15 e-/Å 2 na ekspozycję.
  5. Wróć do trybu wyszukiwania niskiej dawki, przejdź do zapisanej pozycji i zidentyfikuj i wyśrodkuj dobrą rurkę za pomocą kamery CCD. Przełącz się w tryb ostrości, wyreguluj ostrość i ustaw wartość rozmycia, zwykle od 0.5 do 2.5 μm. Przełącz się w tryb ekspozycji, ustaw czas naświetlania 0,3-0,5 sekundy, dla dawki 15 e-/A 2 i zbierz obraz. Obrazy są zbierane na kamerze płytkowej, a filmy powinny być pozostawione na 10 sekund przed wykonaniem ekspozycji.
  6. Przejdź do następnej zapisanej pozycji i powtórz krok 5, aby zebrać więcej obrazów.
  7. Filmy są wywoływane w pełnej mocy D19 przez 12 minut i digitalizowane za pomocą skanera Nikon super coolscan 9000 ED o rozmiarze piksela 6,35 μm. Format plików graficznych to TIFF.

3. Indeksowanie spiralne

Obiekt spiralny może być indeksowany przez dwa parametry: porządek Bessela, n, i numer linii warstwy, l. Każda linia warstwy w transformacie Fouriera, scharakteryzowana przez (n, l), odpowiada zbiorowi linii na powierzchni sieci obiektu spiralnego oznaczonego wskaźnikami (h, k), przy użyciu notacji z kraty 2D. Dla dowolnej (h, k) linia warstwy (nhk, lhk) jest liniową kombinacją dwóch podstawowych wektorów (n10, l10) i ( n01, l01), które są wartościami n i l dwóch głównych linii warstwy (1, 0) i (0, 1). l można uzyskać z wysokości linii warstwy mierzonej wzdłuż osi Z w transformacie Fouriera. Wartość n można oszacować za pomocą następującego równania10

2πRr ≈ Jn ≈ 1.1|n|+0.9   ..................... (1)

gdzie Jn to funkcja Bessela, która określa intensywność n-tej linii warstwy, r to promień obiektu spiralnego, a R to promień maksymalnej amplitudy linii warstwy. Numer linii warstwy, l, jest powiązany z n przez regułę wyboru11

l = tn + um   .................... (2)

gdzie t i u są stałymi helisy. Dla każdej helisy mogą występować dokładnie jednostki u w dokładnie (lub bardzo blisko) t pełnych obrotów.

  1. Zapakuj stosunkowo prostą i długą rurkę o jednolitej średnicy za pomocą programu ELAN12 helixboxer i zapisz obraz w formacie MRC.
  2. Określ odległość powtórzeń śrubowych, c, za pomocą programu opartego na korelacji krzyżowej, takiego jak "imgccf", w pakiecie MRC13.
  3. Oblicz transformatę Fouriera z nową długością pola, która jest całką z odległości powtórzenia, c.
  4. Wybierz dwie główne linie warstwy, które definiują dwa podstawowe wektory kraty powierzchni (1,0) i (0,1).
  5. Zmierz promień rury, r, oraz wysokość i promień dwóch linii warstwy głównej w transformacie Fouriera, odpowiednio l10, R10, l01 R01 (rys. 1).
  6. Obliczyć n10 i n01 zgodnie z równaniem (1).
  7. Ponieważ n wartości są tylko szacunkowe, kilka kombinacji n10 i n01 jest testowanych w późniejszych krokach (patrz krok 4.2) w celu znalezienia prawidłowej symetrii śrubowej za pomocą pakietu programu IHRSR.
  8. Oblicz symetrię opisaną dwiema liczbami rzeczywistymi: obrotem między podjednostkami (Δφ) i wzrostem osiowym (Δz) helisy jednogwiazdowej (n=1). Biorąc pod uwagę wartości l10, l01, n10 i n01, u i t można uzyskać, testując zakres wartości m (na przykład -50<m<50) zgodnie z regułą wyboru. Na koniec Δφ i Δz oblicza się przy użyciu Δφ =360t/u i Δz = c/u.

4. Rekonstrukcja trójwymiarowa

  1. Segmentacja
      cząstek
    1. Otwórz mikrofotografię zawierającą spiralne cząstki za pomocą programu graficznego Boxer, który jest programem w pakiecie EMAN.
    2. Pokrój spiralną cząstkę na nakładające się na siebie segmenty. W panelu sterowania Boxera wybierz tryb Helix i ustaw parametry dla pudełka: rozmiar pudełka powinien być większy niż średnica cząstki, a wartość "Olap" powinna wynosić ̃90% rozmiaru pudełka.
    3. Po kliknięciu lewym przyciskiem myszy na którymś z końców spiralnej cząstki, Boxer automatycznie wygeneruje serię pól cząstek wzdłuż długości helisy.
    4. Zapisz segmenty w ramkach wraz z ich współrzędnymi.
  2. Wstępna rekonstrukcja 3D za pomocą programów
      IHRSR
    1. Odwróć kontrast obrazów krio-EM i zastosuj filtrowanie dolnoprzepustowe14 (opcjonalnie) przed przetworzeniem za pomocą iteracyjnej metody rekonstrukcji helisalnej przestrzeni rzeczywistej (IHRSR).
    2. Otwórz interfejs graficzny programu IHRSR, wpisując "Generator". Zapewnij interfejs graficzny ze wszystkimi informacjami dotyczącymi stosu cząstek w pudełkach, w tym nazwą i ścieżką stosu, liczbą obrazów w stosie, wartościami parametrów symetrii itp. Kliknij przycisk "Zakończ", aby utworzyć skrypt rekonstrukcyjny b25.spi.
    3. Użyj pełnego lub pustego cylindra jako początkowego odniesienia i pozwól, aby procedura powtarzała się, aż nie nastąpią żadne zmiany w zdefiniowanej symetrii, co zwykle następuje po kilku cyklach. Symetria prawej helisy powinna dawać stabilnie zbieżną rekonstrukcję. Rekonstrukcja wygenerowana w ostatnim cyklu zostanie wykorzystana jako wstępny punkt odniesienia do dalszego udoskonalenia. IHRSR wykonuje rekonstrukcję 3D za pomocą programów SPIDER.
  3. Rekonstrukcja z iteracyjnym udoskonalaniem15 Rekonstrukcja 3D wygenerowana przez IHRSR jest teraz używana jako początkowe odniesienie do dodatkowych udoskonaleń. Podczas zagęszczenia symetria śrubowa jest ustalana na poziomie Δφ i Δz, które są określane na podstawie procedury IHRSR.
    1. Określ rozogniskowanie i astygmatyzm obecne na mikrofotografii za pomocą programów CTFFIND3 i CTFTILT16.
    2. Pomnóż segmenty cząstek przez CTF za pomocą programów SPIDER17. Operacja określana jako FT w pakiecie SPIDER służy do obliczania transformaty Fouriera (FFT) obrazu 2D. Następnie FFT jest mnożony przez wartości CTF, określone w poprzednich krokach, przy użyciu operacji zwanej MU w pakiecie SPIDER. Uzyskana wartość jest następnie przekształcana odwrotnie w celu utworzenia nowego obrazu (skorygowanego przez CTF) w przestrzeni rzeczywistej za pomocą operacji SPIDER, ponownie FT.
    3. Wykonaj dopasowywanie projekcji, porównując projekcje objętości odniesienia z obrazami skorygowanymi przez CTF, używając wyrównania do wielu odniesień. Zmiana kąta nachylenia poza płaszczyzną jest ograniczona do +/-10° i próbkowana w krokach co 1°. Wprowadź ograniczenia, takie jak wysokie współczynniki korelacji, kąty w płaszczyźnie bliskie 0° lub 180° oraz ograniczone przesunięcia x dla parametrów wyrównania każdego segmentu. W rekonstrukcji należy uwzględnić tylko te segmenty, które spełniają ograniczenia.
    4. Po każdym iteracyjnym cyklu udoskonalania generowana jest rekonstrukcja 3D przy użyciu projekcji wstecznej i dzielona przez sumę przez CTFˆ2.
    5. Zastosuj symetrię spiralną, aby wygenerować symetryczną objętość. Iteracyjne udoskonalanie jest przerywane, gdy nie nastąpi dalsza poprawa rozdzielczości nowej rekonstrukcji 3D.
    6. Pakiet do przetwarzania obrazu SPIDER jest używany do większości etapów udoskonalania. Szereg operacji jest kontrolowany przez skrypty SPIDER, które są tworzonymi przez użytkownika wsadowymi plikami kontrolnymi zawierającymi sekwencje operacji i wartości parametrów. Ostateczna rekonstrukcja jest obliczana za pomocą programów w pakiecie SPIDER.

5. Reprezentatywne wyniki:

Pojedyncza rurka HIV-1 CA A92E (Rys. 1a) została zapakowana, a jej transformacja Fouriera (Rys. 1b) została obliczona dla indeksowania spiralnego. Dla linii warstw (1, 0) i (0, 1), l10=28, l01=37, R10=55, R01=44. Biorąc pod uwagę promień rury wynoszący 211,57A, przybliżyliśmy n10=-12, n01=11 (tutaj ręczność była z góry określona). Przy powtarzalnej odległości 5195,48A symetria rury została określona jako Δz=6,8093A, Δφ=328,88°. Δz i Δφ zostały oczyszczone do 7,1321A i 328,86° za pomocą IHRSR (rys. 2a), a wstępną rekonstrukcję przedstawiono na rys. 2b. Ostateczna rekonstrukcja (rys. 3), po iteracyjnym udoskonaleniu, znacznie poprawiła mapę gęstości w stosunku do początkowego modelu obliczonego za pomocą IHRSR (rys. 2b).

figure-protocol-1
Rysunek 1. Indeksowanie rurki spiralnej HIV-1 CA. (A) Pojedynczy obraz probówki HIV-1 CA A92E. Podziałka liniowa, 30 nm. (B) Transformata Fouriera rurki pokazanej w (A). Indeksy spiralne (n10=-12, n01=11) są oznaczone. Grot strzałki wskazuje linię warstwy w rozdzielczości 23A.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Wstępna rekonstrukcja z wykorzystaniem IHRSR. (A) Wyznaczanie symetrii dla każdego cyklu iteracyjnego. Δφ i Δz, zaczynając od wartości początkowych, zbiegają się do wartości stabilnych po 10 iteracyjnych cyklach uszlachetniania. (B) Wstępna mapa gęstości 3D po 10 cyklach iteracyjnych.

figure-protocol-3
Rysunek 3. Mapa gęstości 3D po iteracyjnym doprecyzowaniu. (A-C) Mapa gęstości rur CA jest wyświetlana jako trzy ortogonalne wycinki: równoległe do osi rury i blisko powierzchni (A), prostopadłe do osi rury (B) oraz równoległe do i przez oś rury (C). Podziałka liniowa, 10 nm. (D) Renderowanie powierzchni mapy gęstości 3D wyprofilowanej w czasie 1,8 s, obejmującej 100% objętości.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy zestaw protokołów, które zapewniają proste podejście do uzyskiwania struktur 3D obiektów helikalnych. Korzystając z opisanych procedur, uzyskaliśmy strukturę 3D zespołu kapsydu HIV-1 z obrazu pojedynczej probówki (176 segmentów). Struktury o wyższej rozdzielczości można uzyskać, dołączając więcej danych obrazu.

Istnieje kilka krytycznych punktów dla optymalnego gromadzenia i analizy danych: Po pierwsze, podczas przygotowywania próbki cryo-EM, roztwór próbki powinien zostać osuszony, pozostawiając jednolitą, cienką warstwę roztworu, która jest nieco grubsza niż rozmiar próbki. Istnieje kilka różnych sposobów osuszania próbki. W przypadku komórek bakteryjnych i próbek rurkowych, takich jak złożenie CA HIV-1, najbardziej odpowiednie jest osuszanie z jednej strony, szczególnie z tyłu.

Po drugie, należy określić ręczność spirali, ponieważ nie można tego zrobić za pomocą indeksowania spiralnego lub rekonstrukcji. Powszechną praktyką jest stosowanie trawienia przez zamrożenie, a następnie cieniowania obrotowego18 w celu określenia ręczności. Ręczność można również określić po rekonstrukcji, gdy rozdzielczość mapy gęstości jest wystarczająco wysoka; Modele atomowe 3D poszczególnych komponentów powinny dobrze pasować do mapy gęstości, gdy założy się prawidłową ręczność. W przeciwnym razie należy przyjąć odwrotną ręczność.

Po trzecie, podczas przetwarzania obrazu należy stosować filtr Wienera, zarówno do korekcji fazy, jak i amplitudy, aby zmniejszyć wzmocnienie szumów. Ponieważ CTF z pojedynczego obrazu zawsze ma zero przecięć, część informacji w odwrotnej przestrzeni jest tracona. W związku z tym konieczne jest dołączenie wielu zestawów danych projekcji do rekonstrukcji 3D, z których każdy jest obrazowany z różnymi wartościami rozmycia.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Gongpu Zhao i Danxia Ke za wsparcie techniczne. Dziękujemy doktorom Edwardowi Egelmanowi i Niko Grigorieffowi za udostępnienie ich oprogramowania do przetwarzania obrazów. Wyrażamy również uznanie dla personelu, który wspiera ośrodek Structural Biology cryo-EM oraz klaster i siatkę Beowulfa w Szkole Medycznej Uniwersytetu w Pittsburghu. Prace te były wspierane przez GM082251 i GM085043.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Urządzenie jarzeniowo-wyładowcze 100XUrządzenie do jarzenia 100X
Mikroskop Tecnai Polara F30 z pistoletem do emisji polaFEI
Gatan Kamera CCD 4K x 4KGatan
UrządzenieDomowy ręczny tłok grawitacyjny
Quantifoil R2/1 200 siatki z miedzi węglowejQuantifoil Micro Tools
Oprogramowanie EM EMANa href="http://blake.bcm.edu/EMAN/">http://blake.bcm.edu/EMAN/
EM oprogramowanie IHRSRProgramy dostępne w Edward H. Egelmanhttp://people.virginia.edu/~ehe2n/
EM software Spiderhttp://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.htmlMRC
oparte na oprogramowaniuProgramy dostępne w Koji Yonekurahttp://www.riken.jp/biostrmech/index.html
CTFFIND3/CTFTILT i udoskonalanie spiralne w przestrzeni rzeczywistej softwarehttp://emlab.rose2.brandeis.edu/software
do zamrażania wgłębnego < do obróbki śrubowej

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frank, J., Radermacher, M. Three-dimensional reconstruction of single particles negatively stained or in vitreous ice. Ultramicroscopy. 46, 241-262 (1992).
  2. Henderson, R. Structure of Purple Membrane from Halobacterium-Halobium - Analysis of X-Ray-Diffraction Pattern. J Mol Biol. 93, 123-128 (1975).
  3. Egelman, E. H. The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers. J Struct Biol. 157, 83-94 (2007).
  4. Egelman, E. H., Francis, N., Derosier, D. J. F-Actin Is a Helix with a Random Variable Twist. Nature. 298, 131-135 (1982).
  5. Nogales, E., Whittaker, M., Milligan, R. A., Downing, K. H. High-resolution model of the microtubule. Cell. 96, 79-88 (1999).
  6. Jimenez, J. L. Cryo-electron microscopy structure of an SH3 amyloid fibril and model of the molecular packing. Embo J. 18, 815-821 (1999).
  7. Butler, P. J., Klug, A. Assembly of the particle of tobacco mosaic virus from RNA and disks of protein. Nat New Biol. 229, 47-50 (1971).
  8. Namba, K., Yamashita, I., Vonderviszt, F. Structure of the core and central channel of bacterial flagella. Nature. 342, 648-654 (1989).
  9. Byeon, I. J. L. Structural Convergence between Cryo-EM and NMR Reveals Intersubunit Interactions Critical for HIV-1 Capsid Function. Cell. 139, 780-790 (2009).
  10. Toyoshima, C., Unwin, N. Three-dimensional structure of the acetylcholine receptor by cryoelectron microscopy and helical image reconstruction. J Cell Biol. 111, 2623-2635 (1990).
  11. Toyoshima, C. Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. I. Indexing of diffraction patterns. Ultramicroscopy. 84, 1-14 (2000).
  12. Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions. J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).
  13. Yonekura, K., Toyoshima, C. Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. IV. Distortion correction and its combined application with real-space averaging and solvent flattening. Ultramicroscopy. 107, 1141-1158 (2007).
  14. van Heel, M. Single-particle electron cryo-microscopy: towards atomic resolution. Q Rev Biophys. 33, 307-369 (2000).
  15. Sachse, C. High-resolution electron microscopy of helical specimens: A fresh look at Tobacco Mosaic Virus. J Mol Biol. 371, 812-835 (2007).
  16. Mindell, J. A., Grigorieff, N. Accurate determination of local defocus and specimen tilt in electron microscopy. J Struct Biol. 142, 334-347 (2003).
  17. Frank, J. SPIDER and WEB: Processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).
  18. Zhang, P. J., Hinshaw, J. E. Three-dimensional reconstruction of dynamin in the constricted state. Nat Cell Biol. 3, 922-926 (2001).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

HIV 1 CapsidCryo electron MicroscopyHelical ReconstructionIterative Helical Real space ReconstructionIHRSR MethodHelical Indexing3D Density MapLow Dose Data CollectionSpecimen PreparationContrast Transfer Function

Related Articles