Artykuł metodologiczny

Struktura zgromadzeń kapsydu HIV-1 określona za pomocą kriomikroskopii elektronowej i iteracyjnej helikalnej rekonstrukcji w przestrzeni rzeczywistej

19.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3041

⸱

9 sierpnia 2011

 ,  , 
1Department of Structural Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy artykuł opisuje metodę uzyskiwania trójwymiarowej (3D) struktury cząsteczek zmontowanych helikalnie przy użyciu krio-mikroskopii elektronowej. W niniejszym protokole wykorzystujemy zgromadzenia kapsydów HIV-1, aby zilustrować szczegółową procedurę rekonstrukcji 3D w celu uzyskania mapy gęstości za pomocą iteracyjnej metody rekonstrukcji helikalnej w przestrzeni rzeczywistej.

Streszczenie

Kriomikroskopia elektronowa (cryo-EM) w połączeniu z przetwarzaniem obrazów staje się coraz potężniejszym narzędziem do wyznaczania struktury makromolekularnych kompleksów i zgrupowań białkowych. W rzeczywistości mikroskopia elektronowa pojedynczych cząsteczek1 oraz dwuwymiarowa (2D) krystalografia elektronowa2 stały się stosunkowo rutynowymi metodologiami, a za ich pomocą rozwiązano już dużą liczbę struktur. Jednocześnie gwałtownie rozwinęło się przetwarzanie obrazów i trójwymiarowa (3D) rekonstrukcja obiektów helikalnych, w szczególności metoda iteracyjnej rekonstrukcji helikalnej w przestrzeni rzeczywistej (IHRSR)3, która wykorzystuje narzędzia analizy pojedynczych cząsteczek w połączeniu z symetrią helikalną. Wiele bytów biologicznych funkcjonuje w formach włóknistych lub helikalnych, w tym filamenty aktynowe4, mikrotubule5, włókna amyloidowe6, wirusy mozaiki tytoniowej7 oraz wici bakteryjne8. Ponieważ dzięki metodzie IHRSR trójwymiarową mapę gęstości obiektu helikalnego można uzyskać z pojedynczego obrazu projekcyjnego, w przeciwieństwie do wielu obrazów wymaganych do rekonstrukcji 3D obiektu niehelikalnego, analiza strukturalna tak elastycznych i nieuporządkowanych zgrupowań helikalnych jest obecnie możliwa do zrealizowania.

W niniejszym artykule wideo przedstawiamy szczegółowe protokoły uzyskiwania trójwymiarowej (3D) mapy gęstości helikalnego kompleksu białkowego (naszym przykładem jest kapsyd HIV-19), obejmujące protokoły przygotowania próbek do krio-EM, zbierania danych przy niskiej dawce promieniowania w krio-EM, indeksowania helikalnych wzorów dyfrakcyjnych oraz przetwarzania obrazów i rekonstrukcji 3D z wykorzystaniem metody IHRSR. W porównaniu z innymi technikami, krio-EM zapewnia optymalne zachowanie próbek w warunkach zbliżonych do naturalnych. Próbki są zatapiane w cienkiej warstwie lodu witryfikowanego poprzez szybkie mrożenie, a następnie obrazowane w mikroskopach elektronowych w temperaturze ciekłego azotu, przy zastosowaniu niskiej dawki promieniowania w celu zminimalizowania uszkodzeń radiacyjnych. Obrazy próbek są uzyskiwane w warunkach bliskich natywnym, co wiąże się z niskim sygnałem i niskim kontrastem zarejestrowanych mikrografii. Na szczęście proces rekonstrukcji helikalnej został w znacznym stopniu zautomatyzowany, z wyjątkiem indeksowania helikalnego wzoru dyfrakcyjnego. Opisujemy tutaj podejście do indeksowania struktury helikalnej i wyznaczania symetrii helikalnych (parametrów helikalnych) z cyfrowych mikrografii, co jest kluczowym etapem trójwymiarowej rekonstrukcji helikalnej. W skrócie, uzyskujemy wstępną mapę gęstości 3D, stosując metodę IHRSR. Następnie mapa ta jest iteracyjnie dopracowywana poprzez wprowadzenie ograniczeń dla parametrów dopasowania każdego segmentu, co pozwala kontrolować ich stopnie swobody. Dalszą poprawę uzyskuje się poprzez korektę funkcji przenoszenia kontrastu (CTF) mikroskopu elektronowego (korekta amplitudy i fazy) oraz optymalizację symetrii helikalnej kompleksu.

Protokół

1. Przygotowanie mrożonych i nawodnionych próbek do EM

Ponieważ zgromadzenia białka kapsydu (CA) HIV-19 są stabilne jedynie w buforze o wysokim stężeniu soli (1M NaCl), co powoduje silny szum tła w obrazach cryo-EM, stosujemy metodę szybkiego rozcieńczania i osuszania od strony tylnej (back-side blotting), aby przejściowo obniżyć stężenie soli podczas przygotowywania mrożonej, uwodnionej siatki EM.

  1. Poddać działaniu wyładowań żarowych stronę węglową miedzianych siatek Quantifoil R2/1 o oczku 200 mesh przy natężeniu 25mA przez 25 sekund.
  2. Użyć nebulizatora, aby zwiększyć wilgotność w komorze środowiskowej (samodzielnie wykonanego ręcznego plungera grawitacyjnego) do 80%.
  3. W naczyniu FEI Vitrobot Plunger schłodzić etan w stanie ciekłym za pomocą ciekłego azotu. Zamontować naczynie do mrożenia szokowego na ręcznym plungerze grawitacyjnym.
  4. Nanieść 2,5 μl wcześniej przygotowanego roztworu CA na stronę węglową siatki zamocowanej w pincecie, a następnie umieścić pincetę w plungerze tak, aby strona węglowa siatki była skierowana od strony operatora.
  5. Dodać 3 μl buforu rozcieńczającego o niskim zasoleniu (10 mM NaCl) na drugą stronę siatki i natychmiast osuszyć tę stronę za pomocą kawałka papieru filtracyjnego. Cała tylna powierzchnia siatki powinna pozostawać w bezpośrednim kontakcie z papierem filtracyjnym przez około 6 sekund przed jego usunięciem. Bezpośrednio po usunięciu papieru filtracyjnego zanurzyć siatkę w ciekłym etanie.
  6. Wyjąć pincetę z plungera i szybko przenieść siatkę do pudełka do przechowywania siatek.

2. Kriomikroskopia elektronowa struktur rurkowych CA

  1. Umieść mrożoną siatkę w mikroskopie elektronowym FEI Polara G2 pracującym przy napięciu 20kv i wyposażonym w kamerę CCD Gatan 4Kx4K.
  2. W trybie wyszukiwania przy niskiej dawce (low-dose-search mode), przy powiększeniu ~20x i dawce <0,01e-/Å2, przeskanuj całą siatkę w poszukiwaniu obszarów z odpowiednią warstwą lodu i zapisz pozycje tych obszarów w pliku etapu (stage file).
  3. Przywołaj zapisane pozycje i ponownie przeskanuj te obszary przy powiększeniu 390x w trybie wyszukiwania przy niskiej dawce. Do zbierania danych wybierz obszary z jednorodną, cienką warstwą lodu zawierającą dobrze odseparowane, długie tubule nad otworami. Zapisz lokalizacje tych obszarów w drugim pliku etapu.
  4. Przełącz na tryb ekspozycji przy powiększeniu 59 0x, wstaw przysłonę obiektywu 10 μm i dostosuj stygmatyzm obiektywu oraz intensywność wiązki, aby uzyskać dawkę ˜15 e-/Å2 na ekspozycję.
  5. Powróć do trybu wyszukiwania przy niskiej dawce, przejdź do zapisanej pozycji, a następnie zidentyfikuj i wycentruj odpowiednią tubulę za pomocą kamery CCD. Przełącz na tryb ustawiania ostrości, dostosuj ostrość i ustaw wartość defokusu, zazwyczaj od 0,5 do 2,5 μm. Przełącz na tryb ekspozycji, ustaw czas ekspozycji od 0,3 do 0,5 sekundy dla dawki 15 e-/Å2 i wykonaj zdjęcie. Obrazy są rejestrowane na kamerze płytkowej; przed wykonaniem ekspozycji należy odczekać 10 sekund, aby filmy się ustabilizowały.
  6. Przejdź do następnej zapisanej pozycji i powtórz krok 5, aby zebrać więcej obrazów.
  7. Filmy są wywoływane w pełnej mocy utrwalacza D19 przez 12 minut i digitalizowane za pomocą skanera Nikon super coolscan 90 ED przy rozmiarze piksela 6,35 μm. Format plików obrazów to TIFF.

3. Indeksowanie helikalne

Obiekt helikalny można indeksować za pomocą dwóch parametrów: rzędu Bessela, n, oraz numeru linii warstwy, l. Każda linia warstwy w transformacie Fouriera, charakteryzowana przez (n, l), odpowiada zestawowi linii na sieci powierzchniowej obiektu helikalnego oznaczonemu indeksami (h, k), przy użyciu notacji sieci 2D. Dla dowolnego (h, k) linia warstwy (nhk, lhk) jest kombinacją liniową dwóch wektorów podstawowych (n10, l10) oraz (n01, l01), które stanowią wartości n i l dla dwóch głównych linii warstw (1, 0) i (0, 1). Wartość l można wyznaczyć z wysokości linii warstwy mierzonej wzdłuż osi Z w transformacie Fouriera. Wartość n można oszacować za pomocą następującego równania10

2πRr ≈ Jn ≈ 1.1|n|+0.9  .....................(1)

gdzie Jn jest funkcją Bessela, która określa natężenie nth linia warstwy, r to promień obiektu helikalnego, a R to promień maksymalnej amplitudy linii warstwy. Numer linii warstwy, l, jest powiązane z n zgodnie z regułą wyboru11

l = tn + um   ....................(2)

gdzie t i u są stałymi helisy. Dla dowolnej danej helisy może istnieć dokładnie u jednostek w dokładnie (lub bardzo blisko) t pełnych obrotach.

  1. Wyodrębnij fragment względnie prostej i długiej rurki o jednolitej średnicy, korzystając z programu helixboxer z pakietu EMAN12, a następnie zapisz obraz w formacie MRC.
  2. Wyznacz odległość powtórzenia helisą, c, używając programu opartego na korelacji krzyżowej, takiego jak „imgccf” z pakietu MRC13.
  3. Oblicz transformatę Fouriera z nową długością ramki, która stanowi wielokrotność całkowitą odległości powtórzenia c.
  4. Wybierz dwie główne linie warstw definiujące dwa podstawowe wektory sieci powierzchniowej (1,0) i (0,1).
  5. Zmierz promień rurki, r, oraz wysokość i promień dwóch głównych linii warstw w transformacie Fouriera, odpowiednio l10, R10, l01 oraz R01 (Rys. 1).
  6. Oblicz n10 oraz n01 zgodnie z równaniem (1).
  7. Ponieważ wartości n są jedynie szacunkami, w kolejnych krokach (patrz krok 4.2) testuje się kilka kombinacji n10 i n01, aby znaleźć poprawną symetrię helikalną przy użyciu pakietu programów IHRSR.
  8. Oblicz symetrię śrubową opisaną dwiema liczbami rzeczywistymi: kątem obrotu między podjednostkami (Δφ) oraz wzrostem osiowym (Δz) helisy jednogwiazdkowej (n=1). Znając wartości l10, l01, n10 oraz n01, wartości u i t można uzyskać poprzez przetestowanie zakresu wartości m (na przykład -50<m<50) zgodnie z regułą wyboru. Na koniec oblicz Δφ i Δz, stosując wzory Δφ =360t/u oraz Δz =c/u.

4. Rekonstrukcja trójwymiarowa

  1. Segmentacja cząsteczek
    1. Otwórz mikrografię zawierającą cząsteczki helikalne, korzystając z programu graficznego Boxer, który jest częścią pakietu EMAN.
    2. Podziel cząsteczkę helikalną na nakładające się segmenty. W panelu sterowania programu Boxer wybierz tryb Helix i ustaw parametry ramkowania: rozmiar ramki powinien być większy niż średnica cząsteczki, a wartość „Olap” powinna wynosić ˜90% rozmiaru ramki.
    3. Po kliknięciu lewym przyciskiem myszy na obu końcach cząsteczki helikalnej, program Boxer automatycznie wygeneruje serię ramek cząsteczek wzdłuż długości helisy.
    4. Zapisz ramkowane segmenty oraz ich współrzędne.
  2. Wstępna rekonstrukcja 3D przy użyciu programów IHRSR
    1. Odwróć kontrast obrazów cryo-EM i zastosuj filtr dolnoprzepustowy14 (opcjonalnie) przed przetwarzaniem metodą iteracyjnej rekonstrukcji helikalnej w przestrzeni rzeczywistej (IHRSR).
    2. Otwórz interfejs graficzny programu IHRSR, wpisując „Generator”. Wprowadź do interfejsu graficznego wszystkie informacje dotyczące stosu ramkowanych cząsteczek, w tym nazwę i ścieżkę stosu, liczbę obrazów w stosie, wartości parametrów symetrii itp. Kliknij przycisk „Finish”, aby utworzyć skrypt rekonstrukcji, b25.spi.
    3. Użyj litego lub pustego cylindra jako referencji początkowej i pozwól procedurze cyklicznie pracować do momentu, aż nie będzie już zmian w zdefiniowanej symetrii śrubowej, co zazwyczaj następuje po kilku cyklach. Prawoskrętna symetria helikalna powinna zapewnić stabilnie zbieżną rekonstrukcję. Rekonstrukcja wygenerowana w ostatnim cyklu zostanie użyta jako referencja początkowa do dalszego doprecyzowania. IHRSR wykonuje rekonstrukcję 3D przy użyciu programów SPIDER.
  3. Rekonstrukcja z iteracyjnym doprecyzowaniem15 Rekonstrukcja 3D wygenerowana przez IHRSR jest teraz używana jako referencja początkowa do dodatkowego doprecyzowania. Podczas doprecyzowania symetria helikalna jest stała dla Δφ i Δz, które zostały określone w procedurze IHRSR.
    1. Określ defokus i astygmatyzm występujące w mikrografii za pomocą programów CTFFIND3 i CTFTILT16.
    2. Pomnóż segmenty cząsteczek przez CTF przy użyciu programów SPIDER17. Operacja określana jako FT w pakiecie SPIDER służy do obliczenia transformaty Fouriera (FFT) obrazu 2D. Następnie FFT jest mnożone przez wartości CTF określone w poprzednich krokach, przy użyciu operacji MU w pakiecie SPIDER. Otrzymaną wartość poddaje się następnie odwrotnej transformacji, aby utworzyć nowy obraz (skorygowany o CTF) w przestrzeni rzeczywistej, ponownie używając operacji FT w programie SPIDER.
    3. Wykonaj dopasowanie projekcji poprzez porównanie projekcji wolumenów referencyjnych z obrazami skorygowanymi o CTF, stosując wyrównanie wieloreferencyjne. Zmienność kąta nachylenia poza płaszczyzną jest ograniczona do +/-10° i próbkowana w krokach 1°. Wprowadź ograniczenia, takie jak wysokie współczynniki korelacji, kąty w płaszczyźnie bliskie 0° lub 180° oraz ograniczone przesunięcia w osi x, dla parametrów wyrównania każdego segmentu. Do rekonstrukcji włącz tylko te segmenty, które spełniają te ograniczenia.
    4. Po każdym cyklu iteracyjnego doprecyzowania generowana jest rekonstrukcja 3D przy użyciu rzutowania wstecznego, a następnie dzielona przez sumę CTFˆ2.
    5. Zastosuj symetrię helikalną w celu wygenerowania zsymetryzowanego wolumenu. Iteracyjne doprecyzowanie kończy się, gdy nie następuje już dalsza poprawa rozdzielczości nowej rekonstrukcji 3D.
    6. Pakiet przetwarzania obrazów SPIDER jest używany w większości etapów doprecyzowania. Seria operacji jest sterowana przez skrypty SPIDER, które są tworzonymi przez użytkownika plikami sterującymi wsadowymi zawierającymi sekwencje operacji i wartości parametrów. Końcowa rekonstrukcja jest obliczana przy użyciu programów z pakietu SPIDER.

5. Reprezentatywne wyniki:

Pojedyncza rurka HIV-1 CA A92E (Ryc. 1a) została wyodrębniona z tła, a następnie obliczono jej transformatę Fouriera (Ryc. 1b) w celu indeksowania helikalnego. Dla linii warstw (1, 0) i (0, 1) wartości wynosiły: l10=28, l01=37, R10=5, R01=4. Przy promieniu rurki wynoszącym 21.57Å, przyjęto przybliżone wartości n10=-12, n01=1 (tutaj chiralność została określona uprzednio). Przy dystansie powtórzenia wynoszącym 5195.48Å, symetrię śrubową rurki określono jako Δz=6.8093Å, Δφ=328.8°. Wartości Δz i Δφ doprecyzowano do 7.1321Å i 328.86° przy użyciu IHRSR (Ryc. 2a), a wstępna rekonstrukcja przedstawiona jest na Ryc. 2b. Ostateczna rekonstrukcja (Ryc. 3), po iteracyjnym doprecyzowaniu, znacząco poprawiła mapę gęstości w stosunku do modelu wstępnego obliczonego za pomocą IHRSR (Ryc. 2b).

Dyfraktogram rentgenowski, mikroskopia elektronowa; analiza strukturalna rozmieszczenia cząsteczek; schemat.
Rycina 1. Indeksowanie helikalnej rurki CA HIV-1. (A) Obraz pojedynczej rurki CA HIV-1 A92E. Pasek skali, 30 nm. (B) Transformata Fouriera rurki pokazanej na (A). Indeksy helikalne (n10=-12, n01=1) są oznaczone. Grot strzałki wskazuje linię warstwową przy rozdzielczości 23Å.

Analiza krystalograficzna; wykres zmian kątów i odległości w funkcji cykli; obraz struktury atomowej.
Rysunek 2. Wstępna rekonstrukcja z wykorzystaniem IHRSR. (A) Wyznaczanie symetrii śrubowej dla każdego cyklu iteracyjnego. Δφ i Δz, zaczynając od wartości początkowych, zbiegają do wartości stabilnych po 10 cyklach iteracyjnego ulepszenia. (B) Wstępna trójwymiarowa mapa gęstości po 10 cyklach iteracyjnych.

Obraz z kriomikroskopii elektronowej przedstawiający strukturę filamentów białkowych oraz analizę ich ułożenia.
Rysunek 3Trójwymiarowa mapa gęstości po iteracyjnym udoskonaleniu. (A-C) Mapa gęstości rurek CA została przedstawiona w trzech przekrojach ortogonalnych: równoległym do osi rurki i blisko jej powierzchni (A), prostopadłym do osi rurki (B) oraz równoległym do osi rurki i przechodzącym przez nią (C). Paski skali, 10 nm. (D) Renderowanie powierzchni trójwymiarowej mapy gęstości z konturowaniem na poziomie 1,8$\sigma$ obejmujące 10% objętości.

Dyskusja

Przedstawiamy zestaw protokołów zapewniających prosty sposób uzyskiwania struktur 3D obiektów helikalnych. Stosując opisane procedury, otrzymaliśmy strukturę 3D kompleksu kapsydu HIV-1 z obrazu pojedynczej probówki (176 segmentów). Wyższą rozdzielczość struktur można osiągnąć, dołączając większą ilość danych obrazowych.

Istnieje kilka krytycznych punktów dla optymalnego gromadzenia i analizy danych: po pierwsze, podczas przygotowywania preparatu do krio-EM, należy odsączyć roztwór próbki, pozostawiając jednorodną, cienką warstwę roztworu, która jest nieco grubsza niż rozmiar próbki. Istnieje kilka różnych sposobów odsączania próbki. W przypadku komórek bakteryjnych i preparatów rurkowatych, takich jak montaż CA HIV-1, najbardziej odpowiednie jest odsączanie jednostronne, w szczególności od strony tylnej.

Po drugie, należy określić kierunkowość skrętu helisy, ponieważ nie można tego zrobić za pomocą indeksowania helikalnego ani rekonstrukcji. Powszechną praktyką jest stosowanie trawienia mrozowego, a następnie cieniowania obrotowego18 w celu ustalenia kierunkowości. Kierunkowość można również określić po rekonstrukcji, gdy rozdzielczość mapy gęstości jest wystarczająco wysoka; trójwymiarowe modele atomowe poszczególnych komponentów powinny dobrze pasować do mapy gęstości przy założeniu prawidłowej kierunkowości. W przeciwnym razie należy przyjąć kierunkowość przeciwną.

Po trzecie, podczas przetwarzania obrazów należy zastosować filtr Wienera do korekcji zarówno fazy, jak i amplitudy, aby zredukować wzmocnienie szumów. Ponieważ funkcja przenoszenia kontrastu (CTF) dla pojedynczego obrazu zawsze posiada punkty zerowe, część informacji w przestrzeni odwrotnej zostaje utracona. W związku z tym do rekonstrukcji 3D niezbędne jest uwzględnienie wielu zestawów danych projekcyjnych, z których każdy został obrazowany przy innych wartościach defokusu.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować dr. Gongpu Zhao oraz Danxia Ke za wsparcie techniczne. Dziękujemy dr. Edwardowi Egelmanowi i dr. Niko Grigorieffowi za udostępnienie oprogramowania do przetwarzania obrazów. Wyrażamy również wdzięczność pracownikom wspierającym laboratorium krio-EM biologii strukturalnej oraz klaster i sieć Beowulf na School of Medicine Uniwersytetu w Pittsburghu. Praca ta była finansowana z grantów GM082251 oraz GM085043.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Urządzenie do wyładowań żarowych 100XUrządzenie do wyładowań żarowych 100X
Mikroskop Tecnai Polara F30 z emiterem polowym (Field Emission Gun)FEI
Kamera CCD Gatan 4K x 4KGatan
Urządzenie do witryfikacji (plunge-freezing)Własnoręcznie wykonany grawitacyjny plungier manualny
Miedziane siatki z dziurkowanym węglem Quantifoil R2/1 200 meshQuantifoil Micro Tools
Oprogramowanie EM EMANhttp://blake.bcm.edu/EMAN/
Oprogramowanie EM IHRSRProgramy dostępne od Edwarda H. Egelmanahttp://people.virginia.edu/~ehe2n/
Oprogramowanie EM Spiderhttp://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
Oprogramowanie do przetwarzania helikalnego oparte na MRCProgramy dostępne od Kojiego Yonekuryhttp://www.riken.jp/biostrmech/index.html
Oprogramowanie CTFFIND3/CTFTILT oraz oprogramowanie do rafinacji helikalnej w przestrzeni rzeczywistejhttp://emlab.rose2.brandeis.edu/software

Bibliografia

  1. Frank, J., Radermacher, M. Three-dimensional reconstruction of single particles negatively stained or in vitreous ice. Ultramicroscopy. 46, 241-262 (1992).
  2. Henderson, R. Structure of Purple Membrane from Halobacterium-Halobium - Analysis of X-Ray-Diffraction Pattern. J Mol Biol. 93, 123-128 (1975).
  3. Egelman, E. H. The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers. J Struct Biol. 157, 83-94 (2007).
  4. Egelman, E. H., Francis, N., Derosier, D. J. F-Actin Is a Helix with a Random Variable Twist. Nature. 298, 131-135 (1982).
  5. Nogales, E., Whittaker, M., Milligan, R. A., Downing, K. H. High-resolution model of the microtubule. Cell. 96, 79-88 (1999).
  6. Jimenez, J. L. Cryo-electron microscopy structure of an SH3 amyloid fibril and model of the molecular packing. Embo J. 18, 815-821 (1999).
  7. Butler, P. J., Klug, A. Assembly of the particle of tobacco mosaic virus from RNA and disks of protein. Nat New Biol. 229, 47-50 (1971).
  8. Namba, K., Yamashita, I., Vonderviszt, F. Structure of the core and central channel of bacterial flagella. Nature. 342, 648-654 (1989).
  9. Byeon, I. J. L. Structural Convergence between Cryo-EM and NMR Reveals Intersubunit Interactions Critical for HIV-1 Capsid Function. Cell. 139, 780-790 (2009).
  10. Toyoshima, C., Unwin, N. Three-dimensional structure of the acetylcholine receptor by cryoelectron microscopy and helical image reconstruction. J Cell Biol. 111, 2623-2635 (1990).
  11. Toyoshima, C. Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. I. Indexing of diffraction patterns. Ultramicroscopy. 84, 1-14 (2000).
  12. Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions. J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).
  13. Yonekura, K., Toyoshima, C. Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. IV. Distortion correction and its combined application with real-space averaging and solvent flattening. Ultramicroscopy. 107, 1141-1158 (2007).
  14. van Heel, M. Single-particle electron cryo-microscopy: towards atomic resolution. Q Rev Biophys. 33, 307-369 (2000).
  15. Sachse, C. High-resolution electron microscopy of helical specimens: A fresh look at Tobacco Mosaic Virus. J Mol Biol. 371, 812-835 (2007).
  16. Mindell, J. A., Grigorieff, N. Accurate determination of local defocus and specimen tilt in electron microscopy. J Struct Biol. 142, 334-347 (2003).
  17. Frank, J. SPIDER and WEB: Processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).
  18. Zhang, P. J., Hinshaw, J. E. Three-dimensional reconstruction of dynamin in the constricted state. Nat Cell Biol. 3, 922-926 (2001).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rekonstrukcja helikalnametoda IHRSRindeksowanie helikalnetrójwymiarowa mapa gęstościzbieranie danych przy niskiej dawceprzygotowanie preparatufunkcja przenoszenia kontrastu
Struktura zgromadzeń kapsydu HIV-1 określona za pomocą kriomikroskopii elektronowej i iteracyjnej helikalnej rekonstrukcji w przestrzeni rzeczywistej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.