$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Test żywienia krwią u dorosłych (test dawki pojedynczej lub dawka-odpowiedź)
- Zbierz około 150, 4-5-dniowych dorosłych samic komarów i przenieś do osobnej klatki. Powtórz tę czynność, aby uzyskać 6 klatek, jeśli wykonujesz test dawka-odpowiedź. Usuń źródło cukru 1-24 godziny przed testem karmienia.
- Przygotować podstawowy roztwór chemiczny, jak opisano powyżej, biorąc pod uwagę czystość chemii (typowy roztwór podstawowy to 80 mM w wodzie lub buforze soli), a następnie przygotować seryjne rozcieńczenia w wodzie/buforze zgodnie z wymaganiami.
- Dodać 40 μl każdego z rozcieńczeń do 960 μl zdefibrynowanej krwi królika w celu uzyskania pożądanego stężenia testowego. Nałóż folię membranową na jednostkę podającą i uszczelnij gumowym pierścieniem. Przenieś 1 ml krwi za pomocą pipety i podłącz urządzenie do karmienia do urządzenia grzewczego.
- Delikatnie przetrzyj powierzchnię membrany świeżo przygotowanym 10% roztworem kwasu mlekowego i umieść karmnik w klatce dorosłych komarów. Przykryj klatkę ciemną szmatką lub czarnym workiem na śmieci i pozwól komarom żerować przez godzinę.
- Powtórzyć kroki 1.2-1.4 dla pozostałej części roztworów badanych i kontroli ujemnej (tylko we krwi).
- Po zakończeniu karmienia umieść wiadra w temperaturze 4 °C w lodówce na 5 minut, aby znieczulić komary. Usunąć samce komarów i niekarmione samice komarów oraz policzyć i zapisać całkowitą liczbę karmionych i częściowo karmionych komarów poprzez badanie jamy brzusznej.
- Zatrzymaj częściowo i w pełni odżywione samice komarów, dążąc do uzyskania co najmniej 50 komarów karmionych krwią na dawkę.
- Przenieś wiadra do plastikowej wanny lub komory wzrostowej w stałych warunkach 28 °C i 75 - 85% wilgotności względnej (preferowany jest cykl 12 godzin w dzień / 12 godzin w nocy).
- Zapisz całkowitą liczbę martwych/niereagujących komarów po 0,5, 1, 1,5, 2, 24, 48 i 72 godzinach (lub alternatywnych punktach czasowych w zależności od potrzeb) za pomocą arkusza wyników (Tabela 1).
- Trzeciego dnia po karmieniu krwią wprowadź kubek na jajka do klatki i zbieraj jaja przez 72 godziny. Policz całkowitą liczbę jaj wyprodukowanych podczas jednego zabiegu pod mikroskopem preparacyjnym.
- Obliczyć procentową śmiertelność i płodność w funkcji całkowitej liczby karmionych komarów dla każdej grupy badanej i grupy kontrolnej. W razie potrzeby skorygować śmiertelność kontrolną przy użyciu zmodyfikowanego wzoru Abbotta.
- Wyświetlanie danych dotyczących toksyczności i płodności w postaci wykresu histogramu lub krzywej wykładniczej (w przypadku wykonywania testu dawka-odpowiedź) przy użyciu wybranego oprogramowania. W przypadku wykonywania testu dawka-odpowiedź należy obliczyć wartość LD50, LD75 lub LD90 dla badanej chemii w stosunku do kontroli.
- Powtórzyć test co najmniej dwa razy, używając oddzielnych partii komarów w celu uzyskania n = 3 lub więcej kontrprób biologicznych.
Tabela 1. Przykładowy arkusz wyników używany do zapisywania danych z testu odżywiania krwią dorosłych.Typowe dawki stosowane do badania substancji chemicznych antagonistów małych cząsteczek, takich jak amitryptylina, to 50 μM, 100 μM, 200 μM i 400 μM.
| Dorosły komar (3-5 dni) Test miejscowy |
| Data rozpoczęcia: |
| Badacz: |
| Gatunek/Szczep: |
| Typ testu: Jednopunktowa dawka/dawka-odpowiedź |
| A. Śmiertelność (liczba martwych komarów) |
| Czas (godziny) | Dawka 1 | Dawka 2 | Dawka 3 | Dawka 4 | Dawka 5 | kontrola |
| 0,5 | | | | | | |
| 1 | | | | | | |
| 1,5 | | | | | | |
| cyfra arabska | | | | | | |
| Rozdział 2.5 | | | | | | |
| B. Procent śmiertelności |
| Czas (godziny) | Dawka 1 | Dawka 2 | Dawka 3 | Dawka 4 | Dawka 5 | kontrola |
| 0,5 | | | | | | |
| 1 | | | | | | |
| 1,5 | | | | | | |
| cyfra arabska | | | | | | |
| Rozdział 2.5 | | | | | | |