Turbidymetryczny test lizatu amoebocytów limulusowych: technika wykrywania i ilościowego określania zanieczyszczenia endotoksynami w lekach o nanoformach

Streszczenie

Źródło: Neun, B. W. et al., Wykrywanie endotoksyn w nanopreparatach przy użyciu testów lizatu amoebocytów lizatu limulusa (LAL). J. Vis. Exp. (2019)

Ten film opisuje mętny format testu lizatu amebocytów Limulus (LAL) do oszacowania zanieczyszczenia endotoksynami w pegylowanych liposomalnych nanopreparatach doksorubicyny. Zmętnienie roztworu po reakcji endotoksyny z odczynnikiem LAL pomaga oszacować endotoksynę w próbce.

Protokół

1. Przygotowanie próbek nanocząstek

1. Przygotować badaną próbkę w wodzie o czystości LAL.
2. Jeśli pH próbki wykracza poza zakres 6-8, dostosuj pH za pomocą wodorotlenku sodu lub kwasu solnego niezawierającego pirogenów.
3. Używając wody klasy LAL należy przygotować kilka rozcieńczeń badanej próbki. Upewnij się, że najwyższe rozcieńczenie nie przekracza maksymalnego ważnego rozcieńczenia (MVD).

2. Przygotowanie odczynników wspólnych dla formatów LAL

1. Rozcieńczyć stężoną bazę wodorotlenku sodu za pomocą wody z odczynnikiem LAL wolnej od pirogenów, aby przygotować roztwór roboczy o stężeniu 0,1 N.
2. Rozcieńczyć stężony kwas solny wodą z odczynnikiem LAL i przygotować roztwór roboczy o końcowym stężeniu 0,1 N.
3. Przygotowanie wzorca kontrolnego endotoksyny (CSE)
   1. Odtworzyć CSE zgodnie z certyfikatem analizy dostarczonym przez producenta.
      nuta: Zapoznaj się z Tabelą Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat numeru katalogowego i zastosowania danego preparatu CSE w różnych formatach LAL.
4. Przygotowanie odczynnika LAL
   1. Odczynnik LAL należy rozpuścić zgodnie z certyfikatem analizy dostarczonym przez producenta.
      nuta: Szczegółowe informacje na temat numeru katalogowego i zastosowania danej formulacji odczynnika LAL w różnych formatach LAL można znaleźć w Tabeli Materiałów.

3. Test zmętnienia LAL

1. Przygotowanie wzorców kalibracyjnych
   1. Używając 900 μl wody klasy LAL i 100 μl CSE, przygotuj tyle rozcieńczeń pośrednich, ile potrzeba, aby umożliwić przygotowanie wzorca kalibracyjnego o zakresie stężeń od 0,001 do 1 EU/ml.
   2. Najpierw oznacz probówki i dodaj 900 μl wody klasy LAL do każdej probówki. Następnie dodać 100 μl 10 EU/ml roztworu, aby przygotować wzorzec kalibracyjny o stężeniu 1EU/ml.
   3. Powtórzyć seryjne 10-krotne rozcieńczenie, jak opisano powyżej, aby przygotować trzy niższe wzorce kalibracyjne. Sprawdzić, czy przygotowano cztery wzorce kalibracyjne w zakresie od 0,001 do 1 EU/ml.
2. Przygotowanie kontroli jakości
   1. Przygotuj kontrolę jakości 0,05 EU/ml, łącząc 50 μl roztworu CSE o stężeniu 1 EU/ml z 950 μl wody klasy LAL.
3. Przygotowanie kontroli hamowania/wzmacniania (IEC)
   1. Przygotować IEC o stężeniu 0,05 EU/ml, łącząc 25 μl 1 EU/ml roztworu CSE i 475 μl badanego nanomateriału w danym rozcieńczeniu.
4. Procedura doświadczalna
   1. Pozwól instrumentowi się rozgrzać, włączając go około 30 minut wcześniej. Ustaw długość fali detekcji na 660 nm, ponieważ jest to odpowiednie dla zmętnienia LAL.
   2. Zaloguj się, wpisując nazwę użytkownika i hasło.
   3. Otwórz oprogramowanie (Spis materiałów), klikając odpowiednią ikonę na ekranie komputera.
   4. Wybierz opcję Zbieraj dane na ekranie głównym oprogramowania. Wprowadź identyfikator testu i informacje o grupie danych w odpowiednim miejscu na karcie Ogólne na ekranie głównym.
   5. Kliknij kartę Sprzęt. Wybierz typ instrumentu z menu rozwijanego.
   6. Ustaw długość fali detekcji na 660 nm, ponieważ jest to odpowiednie dla zmętnienia LAL, wybierając metodę zmętnienia RAL.
   7. Sprawdź, czy na ekranie pojawia się numer seryjny, identyfikator systemu i informacje o porcie szeregowym. Kliknij przycisk OK. Kliknij OK jeszcze raz, aby potwierdzić.
   8. Wprowadź identyfikator próbki w tej samej kolejności, w jakiej próbka jest testowana. Użyj domyślnych przycisków, aby wprowadzić kontrolę ujemną, krzywą wzorcową i próbki testowe.
   9. Przygotować zduplikowane probówki dla każdej próbki i dodać 200 μl (stosunek testowy 4:1) lub 100 μl (stosunek testowy 1:1) kontroli ujemnej (woda), wzorce kalibracyjne, kontrola jakości, IEC i nanocząstki testowe do wstępnie znakowanych szklanych probówek.
   10. Dodaj 50 μl (stosunek testowy 4:1) lub 100 μl (stosunek testowy 1:1) odczynnika LAL do pierwszej fiolki testowej, krótko ją wymieszaj i włóż do szczeliny testowej w karuzeli instrumentów. Jeśli stosuje się stosunek 1:1, objętość odczynnika LAL wynosi 100 μL.
   11. Powtórzyć procedurę opisaną powyżej dla innych próbek. Przetwarzaj próbki pojedynczo.
        

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
wodorotlenek sodu	Sigma	Zobacz materiał S2770	W razie potrzeby służy do regulacji pH próbki tak, aby wynosiło 6-8
kwas solny	Sigma	Zobacz materiał H9892	W razie potrzeby służy do regulacji pH próbki tak, aby wynosiło 6-8
Odczynnik LAL	Współpracownicy Cape Cod	Zobacz materiał T0051	Ten odczynnik może być używany tylko z testem zmętnienia
Kontroluj standard endotoksyny	Współpracownicy Cape Cod	E0005	Odczynnik ten może być stosowany do testów zmętnienia i zakrzepów żelowych
Woda klasy LAL	Współpracownicy Cape Cod	Zobacz materiał WP0501	Ten odczynnik może być używany z dowolnym formatem LAL
Bufor Glucashield	Współpracownicy Cape Cod	Zobacz materiał GB051-25	Stosowany w celu zapobiegania fałszywie dodatniej odpowiedzi na beta-glukany
Jednorazowe szklane probówki do rozcieńczania bez endotoksyn 12 x 75 mm	Współpracownicy Cape Cod	TB240	Probówki te mogą być używane ze wszystkimi trzema testami
Jednorazowe szklane probówki reakcyjne wolne od endotoksyn 8 x 75 mm	Współpracownicy Cape Cod	TK100	Probówki te mogą być używane do oznaczania zmętnienia i chromogenności
Wolne od pirogenów końcówki o pojemnościach 0,25 i 1,0 ml	FIRMA RAININ	Zobacz materiał PPT25, PPT10	Końcówki i pipety mogą adsorbować endotoksyny i uwalniać substancje wymywalne, które zakłócają test LAL. Te końcówki RAININ są używane, ponieważ ich optymalna wydajność w teście LAL została zweryfikowana i potwierdzona
Probówki do mikrowirówek bez pirogenów, 2,0 ml	Eppendorf	22600044	Można użyć innych równoważnych materiałów eksploatacyjnych
Końcówki kombinowane z opłatą pirogenową, 5 ml	Eppendorf	30089669	Można użyć innych równoważnych materiałów eksploatacyjnych
Powtórz pipetor	Eppendorf	4982000020	Można użyć innych równoważnych materiałów eksploatacyjnych
Mikrocetrifug	dowolna marka		Można użyć dowolnej marki
Lodówka, 2-8 C	dowolna marka		Można użyć dowolnej marki
wir	dowolna marka		Można użyć dowolnej marki
Zamrażarka, -20 C	dowolna marka		Można użyć dowolnej marki
Czytnik Pyros Kinetix lub Pyros Kinetix Flex	Współpracownicy Cape Cod	Zobacz materiał PKF96	Można użyć innych instrumentów. Jednak odczynniki LAL i wzorce endotoksyn stosowane w tym teście mogą wymagać optymalizacji. W przypadku korzystania z innego oprzyrządowania należy zapoznać się z instrukcjami producentów przyrządu i zestawu LAL

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: