Test lizatu amebocytów żelowo-skrzepowych limulus: metoda wykrywania endotoksyn bakteryjnych w preparatach nanocząsteczkowych

Streszczenie

Źródło: Neun, B. W. et al., Wykrywanie endotoksyny w nanopreparatach przy użyciu testów lizatu amoebocytów lizatu limulusa (LAL). J. Vis. Exp. (2019).

Ten film opisuje test żelowo-skrzepowy w celu określenia obecności endotoksyn bakteryjnych w nanopreparatach przy użyciu lizatu lizatu lizatu lizatu pochodzącego z komórek krwi krabów podkowiastych. Test pomaga w testowaniu pod kątem zanieczyszczenia endotoksynami produktów farmaceutycznych, w tym preparatów na bazie nano.

Protokół

1. Przygotowanie próbek nanocząstek

1. Przygotować badaną próbkę w wodzie o czystości LAL.
2. Jeśli pH próbki wykracza poza zakres 6-8, dostosuj pH za pomocą wodorotlenku sodu lub kwasu solnego niezawierającego pirogenów.
3. Używając wody o czystości LAL, przygotuj kilka rozcieńczeń badanej próbki. Upewnij się, że najwyższe rozcieńczenie nie przekracza maksymalnego ważnego rozcieńczenia (MVD).

2. Przygotowanie odczynników wspólnych dla formatów LAL

1. Rozcieńczyć stężoną bazę wodorotlenku sodu za pomocą wody z odczynnikiem LAL wolnej od pirogenów, aby przygotować roztwór roboczy o stężeniu 0,1 N.
2. Rozcieńczyć stężony kwas solny wodą z odczynnikiem LAL i przygotować roztwór roboczy o końcowym stężeniu 0,1 N.
3. Przygotowanie wzorca kontrolnego endotoksyny (CSE)
   1. Odtworzyć CSE zgodnie z certyfikatem analizy dostarczonym przez producenta.
      nuta: Zapoznaj się z Tabelą Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat numeru katalogowego i zastosowania danego preparatu CSE w różnych formatach LAL.
4. Przygotowanie odczynnika LAL
   1. Odczynnik LAL należy rozpuścić zgodnie z certyfikatem analizy dostarczonym przez producenta.
      nuta: Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat numeru katalogowego i zastosowania danej formulacji odczynnika LAL w różnych formatach LAL.

3. Żel-skrzep LAL

UWAGA: Ten test identyfikuje obecność endotoksyn w próbce na podstawie obserwacji wzrokowej i wykrycia skrzepu w probówce reakcyjnej. Kroki eksperymentalne opisano poniżej. Użyj arkusza stołu, aby zapisać wyniki. Arkusz ten nie jest obowiązkowy i dopuszczalne są również inne sposoby zapisywania wyników testu. Przykład takiego arkusza ławki znajduje się w materiałach uzupełniających dla wygody czytelnika. Lambda (l) jest czułością testu żelowo-skrzepowego i wynosi 0,03 EU/ml.

1. Oznacz tyle probówek reakcyjnych, ile potrzeba, aby pomieścić liczbę analizowanych próbek testowych. Szczegółowe informacje na temat liczby powtórzeń użytych w kroku 1, kroku 2 i kroku 3 testu można znaleźć w arkuszu laboratoryjnym.
2. Podwielokrotność 100 μl wody, próbki kontrolnej lub próbki testowej na probówkę.
3. Przygotować CSE tak, aby końcowe stężenie było równe 4λ.
4. Połączyć 100 μl wyżej wymienionego wzorca ze 100 μl wody lub badanej próbki, aby uzyskać końcowe stężenie CSE 2λ. Powtórz jeszcze trzy razy, aby uzyskać lambda i pół-lambda oraz ćwiartkę lambda.
5. Upewnij się, że temperatura w łaźni wodnej wynosi 37 °C.
6. Dodać 100 μl lizatu na probówkę, krótko wymieszać i umieścić stojak ze wszystkimi probówkami w łaźni wodnej na 1 godzinę.
7. Odwróć rurkę płynnym ruchem.
8. Ręcznie zapisuj wyniki za pomocą "+" (twardy skrzep) lub "-" (brak skrzepu lub luźny skrzep) na arkuszu ławki.
9. Kontynuuj analizę zgodnie z USP BET 85; użyj arkusza ławki jako materiału pomocniczego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynnik LAL	Współpracownicy Cape Cod	Zobacz materiał G5003	Ten odczynnik jest specyficzny dla testu zakrzepów żelowych
Kontroluj standard endotoksyny	Współpracownicy Cape Cod	E0005	Odczynnik ten może być stosowany do oznaczania zmętnienia i zakrzepów żelu
wodorotlenek sodu	Sigma	Zobacz materiał S2770	W razie potrzeby służy do regulacji pH próbki tak, aby wynosiło 6-8
kwas solny	Sigma	Zobacz materiał H9892	W razie potrzeby służy do regulacji pH próbki tak, aby wynosiło 6-8
Woda klasy LAL	Współpracownicy Cape Cod	Zobacz materiał WP0501	Ten odczynnik może być używany z dowolnym formatem LAL
Bufor Glucashield	Współpracownicy Cape Cod	Zobacz materiał GB051-25	Stosowany w celu zapobiegania fałszywie dodatniej odpowiedzi na beta-glukany
Jednorazowe szklane probówki do rozcieńczania bez endotoksyn 12 x 75 mm	Współpracownicy Cape Cod	TB240	Probówki te mogą być używane ze wszystkimi trzema testami
Jednorazowe szklane probówki reakcyjne wolne od endotoksyn 10 x 75 mm	Współpracownicy Cape Cod	Zobacz materiał TS050	Probówki te są przeznaczone do stosowania z testem żelowo-skrzepowym
Wolne od pirogenów końcówki o pojemnościach 0,25 i 1 ml	FIRMA RAININ	Zobacz materiał PPT25, PPT10	Końcówki i pipety mogą adsorbować endotoksyny i uwalniać substancje wymywalne, które zakłócają test LAL. Te końcówki RAININ są używane, ponieważ ich optymalna wydajność w teście LAL została zweryfikowana i potwierdzona
Probówki do mikrowirówek bez pirogenów, 2,0 ml	Eppendorf	22600044	Można użyć innych równoważnych materiałów eksploatacyjnych
Końcówki kombinowane z opłatą pirogenową, 5 ml	Eppendorf	30089669	Można użyć innych równoważnych materiałów eksploatacyjnych
Powtórz pipetor	Eppendorf	4982000020	Można użyć innych równoważnych materiałów eksploatacyjnych
Mikrocetrifug	Dowolna marka		Można użyć dowolnej marki
Lodówka, 2-8°C	Dowolna marka		Można użyć dowolnej marki
wir	Dowolna marka		Można użyć dowolnej marki
Zamrażarka, -20 C	Dowolna marka		Można użyć dowolnej marki
Łaźnia wodna, 37° C	Dowolna marka		Można użyć dowolnej marki, jednak ważne jest, aby wyłączyć cyrkulację wody lub użyć niekrążącej kąpieli wodnej, ponieważ przepływ wody wpłynie na tworzenie się skrzepów i doprowadzi do fałszywie ujemnych wyników

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: