Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Izolacja erytrocytów z krwi pełnej
- Dodać 500 μl krwi pełnej w kwaśnej dekstrozie cytrynianu (ACD) (przechowywanej w temperaturze 4 °C) do probówki mikrowirówkowej.
nuta: Krew pełną zakupiono w ACD. Według firmy 1,5 ml ACD dodaje się do 7 ml krwi pełnej (8,5 ml objętości całkowitej).
- Odwirować krew pełną o sile 700 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT) i usunąć przezroczyste osocze i cienką powłokę kożuchową za pomocą pipety, aby pozostawić czerwoną warstwę erytrocytów.
- Przygotować 1 l roztworu Ringera zawierającego 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO4, 32 mM HEPES, 5 mM glukozy i 1 mM CaCl2. Dostosuj pH do 7,4, dodając 2 μl kropli 1,0 M NaOH. Aby przygotować bezglukozowy roztwór Ringera, postępuj zgodnie z tym samym protokołem, ale nie dodawaj glukozy do roztworu.
- Przemyć erytrocyty 2x w roztworze Ringera, zawieszając osad komórkowy w 1,5 ml roztworu Ringera, odwirowując przy 700 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usuwając supernatant.
- Wykonaj 0,4% hematokrytu, ponownie zawieszając 40 μl osadu erytrocytów w 9 960 μl bezglukozowego roztworu Ringera, aby osiągnąć końcową objętość 10 ml.
nuta: Hematokryt to termin używany w odniesieniu do ułamka objętościowego erytrocytów w zawiesinie. 0,4% hematokryt to zawiesina zawierająca 0,4% erytrocytów.
- Inkubować zawiesinę komórkową w temperaturze 37 °C przez 7 dni.
2. Leczenie erytrocytów jonomycyną i pomiar hemolizy
- Rozpuścić 1 mg soli wapniowej jonomycyny w 630 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) do osiągnięcia końcowego stężenia 2 mM. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Pobrać 1 ml 0,4% hematokrytu z kroku 1.5 i dodać 0,5 μl 2 mM jonomycyny, aby osiągnąć końcowe stężenie 1 μM. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
- Użyj 1 ml hematokrytu bez leczenia jonomycyną jako kontrolę negatywną.
- Odwirować hematokryty poddane działaniu jonomycyny i niepoddane działaniu jonomycyny przy 700 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć ich supernatanty, aby pozostawić osadki komórkowe na dnie probówek.
- Przemyć komórki 3x roztworem Ringera, zawieszając granulki komórek w 1,5 ml roztworu Ringera, odwirowując przy 700 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucając supernatanty.
- Aby zmierzyć hemolizę, dodać 1 ml niepoddanego działaniu 0,4% hematokrytu z kroku 1,5 do probówki mikrowirówki i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C jako kontrolę ujemną dla hemolizy (0%).
- Dodać 1 ml niepoddanego działaniu 0,4% hematokrytu z etapu 1,5 do probówki mikrowirówki i wirować przy 700 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i dodać 1 ml wody destylowanej do osadu komórkowego i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C jako kontrolę pozytywną do hemolizy (100%).
- Dodać 1 ml 0,4% hematokrytu poddanego działaniu jonomycyny z kroku 2.2 do probówki mikrowirówkowej.
- Odwirować niepoddane działaniu substancji komórki, komórki poddane działaniu środka oraz komórki w wodzie destylowanej o stężeniu 700 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Pobrać 200 μl supernatantów i dodać do płytki 96-dołkowej.
- Zmierzyć absorbancję przy długości fali 541 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
- Oblicz hemolizę za pomocą równania 1:
% hemoliza = (AT - A0)/(A100 - A0)*100
gdzie A0 to absorbancja erytrocytów w roztworze Ringera, A100 to absorbancja erytrocytów w wodzie, a AT to absorbancja erytrocytów traktowanych przez jonomycynę.
