Test ślizgowych włókien aktynowych: test ruchliwości in vitro w celu zbadania translokacji włókien aktynowych na unieruchomione miozyny

Streszczenie

Źródło: Tripathi, A., et al. Specyficzne dla miozyny adaptacje testów ruchliwości opartych na mikroskopii fluorescencyjnej in vitro. J. Vis. Exp. (2021).

W tym filmie przeprowadzamy test ruchliwości in vitro, aby przeanalizować interakcje aktyna-miozyna. Ślizgający się ruch włókien aktynowych na unieruchomionych cząsteczkach miozyny jest wizualizowany za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Protokół

1. Test włókien aktynowych ślizgowych

1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych
   1. Przygotować 1% roztwór nitrocelulozy w octanie amylu.
   2. Zaopatrzyć się w naczynie do hodowli tkankowej (150 x 25 mm) i na dno naczynia dodać okrągłą bibułę filtracyjną (o średnicy 125 mm).
   3. Załaduj osiem kwadratowych szkiełek nakrywkowych nr 1,5 o grubości 22 mm na stojak i umyj około 2-5 ml 200-procentowego etanolu, a następnie 2-5 ml wody destylowanej (dH₂O). Powtórz ten krok prania, kończąc na wodzie. Następnie całkowicie wysusz szkiełka nakrywkowe za pomocą przewodu z filtrowanym powietrzem lub przewodu N₂.
   4. Weź jedno szkiełko nakrywkowe i powoli odpipetuj 10 μl 1% roztworu nitrocelulozy wzdłuż jednej krawędzi szkiełka. Następnie, jednym płynnym ruchem, rozprowadź go na pozostałej części szkiełka nakrywkowego, używając strony gładkiej końcówki do pipety o pojemności 200 μl. Umieść to szkiełko nakrywkowe na naczyniu do hodowli tkankowych nitrocelulozową stroną do góry. Powtórzyć tę czynność dla pozostałych szkiełek nakrywkowych i pozostawić je do wyschnięcia podczas przygotowywania pozostałych odczynników, a następnie użyć szkiełek nakrywkowych w ciągu 24 godzin po nałożeniu
   powłoki.
2. Przygotowanie komory
   1. Przetrzyj szkiełko mikroskopowe papierem do soczewek optycznych, aby usunąć duże zanieczyszczenia. Wytnij dwa kawałki taśmy dwustronnej o długości około 2 cm.
   2. Umieść jeden kawałek wzdłuż środka dłuższej krawędzi szkiełka mikroskopowego. Upewnij się, że krawędź taśmy jest wyrównana z krawędzią suwaka. Umieść drugi kawałek taśmy około 2 mm poniżej pierwszego kawałka taśmy, tak aby oba były równoległe i wyrównane. W ten sposób powstaje komora przepływowa, która może pomieścić około 10 μl roztworu (patrz rysunek 1).
   3. Weźmy jedno z szkiełek nakrywkowych pokrytych nitrocelulozą z części 1. Ostrożnie przykleić szkiełko nakrywkowe do taśmy w taki sposób, aby strona pokryta nitrocelulozą stykała się bezpośrednio z taśmą (patrz Rysunek 1). Za pomocą końcówki do pipet delikatnie dociśnij złącze taśmy ślizgowej, aby upewnić się, że szkiełko nakrywkowe prawidłowo przylega do szkiełka. Odetnij nadmiar taśmy zwisającej z krawędzi zjeżdżalni za pomocą żyletki.
3. Przygotowanie aktyny
   1. Uzyskać 20 μM F-aktyny przez polimeryzację aktyny globularnej (G-aktyny) w buforze polimeryzacyjnym (50 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 25 mM MOPS (pH 7,0) w temperaturze 4 °C przez noc.
   2. Rozcieńczyć F-aktynę do 5 μM w buforze ruchliwości (20 mM MOPS, 5 mM MgCl₂, 0,1 mM EGTA, 1 mM DTT (pH 7,4)). Oznaczyć co najmniej 1,2x molowym nadmiarem rodaminy-falloidyny. Pozostaw (przykryte folią aluminiową) na co najmniej 2 godziny na lodzie. Może być używany przez okres do 1-2 miesięcy i przechowywany na lodzie.
4. Wykonywanie testu ślizgowego włókna aktynowego miozyny 5a
   UWAGA: W tej sekcji podano szczegółowe informacje na temat testu ślizgowego miozyny 5a (HMM).
   1. Przygotować roztwory miozyny 5a opisane w Tabeli 1 i przechowywać je na lodzie.
   2. Przepuścić 10 μl miozyny 5a (50-100 nM) przez komorę przepływową i odczekać 1 min.
   3. Przepływ w 10 μl 1 mg/ml BSA w 50 mM MB z 1 mM DTT (bufor o niskiej zawartości soli). Powtórz to pranie jeszcze dwa razy i odczekaj 1 minutę po trzecim praniu. Użyj rogu bibułki lub bibuły filtracyjnej, aby przesiąknąć roztwór przez kanał, delikatnie umieszczając róg bibuły przy wyjściu z komory przepływowej.
   4. Umyć 10 μl 50 mM MB z 1 mM naziemnej telewizji cyfrowej. Powtórz to pranie jeszcze dwa razy.
   5. Przepłyń 10 μl roztworu czarnej aktyny (5 μM F-aktyny, 1 μM kalmoduliny i 1 mM ATP w 50 mM MB z 1 mM DTT), aby wyeliminować "martwe głowy".
      1. Odpipetować roztwór za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i igły 27 G, aby ściąć włókna aktyny przed wprowadzeniem roztworu do komory. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy i odczekaj 1 minutę po trzecim razie. Wystarczy około 20 pipetowania.
      2. Aby wykonać wirowanie "martwej głowy", dodaj stechiometryczną ilość F-aktyny do miozyny w obecności 1 mM ATP i 1 mM MgCl₂ przy stężeniu soli 500 mM. Następnie ultrawirować przy 480 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Martwa miozyna będzie w granulce.
   6. Przepływ w 50 μL z 50 mM MB z 1 mM DTT i 1 mM ATP w celu wyczerpania komory wolnych filamentów aktynowych.
   7. Umyć 10 μl 50 mM MB z 1 mM naziemnej telewizji cyfrowej. Powtórz to płukanie jeszcze dwa razy, aby opróżnić komorę z dowolnego ATP.
   8. Przepłynąć w 10 μl roztworu 20 nM aktyny rodaminy (Rh-aktyny) zawierającego 1 mM DTT w 50 mM MB i odczekać 1 minutę, aby umożliwić ścisłe wiązanie włókien aktyny z miozyną 5a przyczepioną do powierzchni szkiełka nakrywkowego.
   9. Umyć 10 μl 50 mM MB za pomocą 1 mM DTT, aby zmyć włókna Rh-aktyny niezwiązane z powierzchnią. Powtórz to pranie jeszcze dwa razy.
   10. Przepłynąć w 30 μl buforu końcowego.
   11. Rejestruj obrazy pod mikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu długości fali wzbudzenia 561 nm w celu wizualizacji Rh-aktyny. Odpowiedni czas naświetlania to 200 ms przy mocy lasera 1,4 mW, co daje łączny czas akwizycji 0,5-1 min.
       UWAGA: Upewnij się, że szybkość akwizycji jest odpowiednio wyskalowana do prędkości poruszających się włókien. Ważną kwestią przed zebraniem danych do wykorzystania w programach śledzących jest liczba klatek na sekundę podczas akwizycji. Ruchy subpikseli między klatkami spowodują przeszacowanie prędkości, a do uzyskania dokładnych wartości wymagane są ruchy rzędu kilkuset nanometrów. Optymalna szybkość akwizycji obejmuje ślizganie się aktyny na odległość co najmniej jednego piksela między klatkami. W przypadku mikroskopu TIRF użytego do obrazowania tutaj próg ten przekłada się na 130 nm; W związku z tym, miozyna, która ma przemieszczać się z prędkością 1 μm/s, musi być obrazowana z szybkością 5 klatek/s (interwał 0,2 s), aby osiągnąć 200 nm ruchu, podczas gdy miozyna, która ma przemieszczać się z prędkością 10 nm/s, wymaga 0,05 klatki/s (odstępy 20 s). W związku z tym na tym etapie dane mogą być próbkowane w dół, jeśli zajdzie taka potrzeba.

Tabela 1: używane w testach ślizgowych

Nazwa bufora	Skład: (M5a)	Skład: (NM2b)	Zastosowany stopień (kroki) (M5a/NM2b)	Komentarze
4X Bufor ruchliwości (4X MB)	MOPS 80 mM, pH 7,2	MOPS 80 mM, pH 7,2		Filtruj próżniowo i przechowuj w temperaturze 4°C
	20 mM MgCl2	20 mM MgCl2
	0,4 mM EGTA	0,4 mM EGTA
	Odczyn pH 7,4	Odczyn pH 7,4
>50 mM bufor ruchliwości soli (50 mM MB)	25% v/v 4X MB	25% v/v 4X MB		Filtruj próżniowo i przechowuj w temperaturze 4°C
	50 mM KCl	50 mM NaCl
	Zwiększ głośność za pomocą dH2O	Zwiększ głośność za pomocą dH2O
500 mM bufor ruchliwości soli (500 mM MB)	Nie dotyczy	25% v/v 4X MB		Filtruj próżniowo i przechowuj w temperaturze 4°C
		500 mM NaCl
		Zwiększ głośność za pomocą dH2O
Miozyna	0,05-0,1 μM miozyny	0,2 μM miozyny	4.2	Trzymaj się lodu.
	1 mM naziemna telewizja cyfrowa	1 mM naziemna telewizja cyfrowa
	Rozcieńczyć w 50 mM MB	Rozcieńczyć w 500 mM MB
1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA)	1 mg/ml masy ciała	1 mg/ml masy ciała	4.3	Trzymaj się lodu.
	Rozcieńczyć w 50 mM MB	Rozcieńczyć w 500 mM MB
	1 mM naziemna telewizja cyfrowa	1 mM naziemna telewizja cyfrowa
5 μM Nieoznakowana F-aktyna w 50 mM MB (aktyna)	5 μM nieznakowana F-aktyna	5 μM nieznakowana F-aktyna	4.5	Trzymaj się lodu. Ścinaj aktynę, pipetując w górę iw dół 5-10 razy lub za pomocą strzykawki.
	1 μM kalmodulina (CaM)	1 mM ATP
	1 mM ATP	0,2 mM CaCl2
	Rozcieńczyć w 50 mM MB	1 μM CaM
		Kinaza łańcucha lekkiego miozyny 1–10 nM (MLCK)
		Rozcieńczyć w 50 mM MB
MB z 1 mM DTT i 1 mM ATP	1 mM naziemna telewizja cyfrowa	1 mM naziemna telewizja cyfrowa	4.6	Trzymaj się lodu.
	1 mM ATP	1 mM ATP
	Rozcieńczyć w 50 mM MB	Rozcieńczyć w 50 mM MB
MB z naziemną obsługą naziemną	1 mM naziemna telewizja cyfrowa	1 mM naziemna telewizja cyfrowa	4.4, 4.7, 4.9	Trzymaj się lodu.
	Rozcieńczyć w 50 mM MB	Rozcieńczyć w 50 mM MB
20 nM F-aktyna rodamino-falloidyna (Rh-aktyna)	20 nM F-aktyna rodamino-falloidyna	20 nM F-aktyna rodamino-falloidyna	4.8	Trzymaj się lodu. Nie wirować.
	1 mM naziemna telewizja cyfrowa	1 mM naziemna telewizja cyfrowa
	Rozcieńczyć w 50 mM MB	Rozcieńczyć w 50 mM MB
Końcowy bufor	50 mM KCl	0,7% metylocelulozy (opcjonalnie)	4.10	Dodaj glukozę, oksydazę glukozową i katalazę bezpośrednio przed przeprowadzeniem eksperymentu. Trzymaj na lodzie.
	MOPS 20 mM, pH 7,2	50 mM NaCl
	5 mM MgCl2	MOPS 20 mM, pH 7,2
	0,1 mM EGTA	5 mM MgCl2
	1 mM ATP	0,1 mM EGTA
	50 mM naziemna telewizja cyfrowa	1 mM ATP
	1 μM kalmodulina	50 mM naziemna telewizja cyfrowa
	2,5 mg/ml glukozy	1–10 nM MLCK
	100 μg/ml oksydazy glukozowej	0,2 mM CaCl2
	40 μg/ml katalazy	1 μM kalmodulina
		2,5 mg/ml glukozy
		100 μg/ml oksydazy glukozowej
		40 μg/ml katalazy

Wyniki

Rysunek 1: Przygotowanie funkcjonalizowanych komór przepływowych. (A) Zacznij od oczyszczonego szkiełka mikroskopowego, dwóch kawałków taśmy dwustronnej przyciętych na około 2 cm i funkcjonalnego szkiełka nakrywkowego. (B) Dodaj taśmę do środka szkiełka mikroskopowego. (C) Przymocuj szkiełko nakrywkowe do taśmy z powłoką (tj. nitrocelulozą) skierowa...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Octan amylu	Branże badawcze Ladd	Numer katalogowy: 10825
Atp	Millipore Sigma	A7699
Albumina surowicy bydlęcej	Millipore Sigma	Numer katalogowy: 5470
Kalmodulina		PMID: 2985564
Katalazy	Millipore Sigma	Zobacz materiał C40
Okrągła bibuła filtracyjna - test ślizgowy	Millipore Sigma	WHA1001125
Stojak na szkiełka nakrywkowe	Millipore Sigma	Z688568-1EA
Szkiełka nakrywkowe: Test włókien o działaniu ślizgowym	VWR Polska	Numer telefonu 48366-227
DL-ditiotreitol	Millipore Sigma	D0632
Taśma dwustronna	Magazyn biurowy	909955
EGTA (EGTA)	Millipore Sigma	E4378
etanol	Fischer Naukowy	Certyfikat A4094
G-aktyna		PMID: 4254541	Zapas G-aktyny można przechowywać w temperaturze 200 μM w cieczy N2.
glukoza	Millipore Sigma	Kontroler G8270
Oksydaza glukozowa	Millipore Sigma	Zobacz materiał G2133
Kcl	Fischer Naukowy	Zobacz materiał P217-500
Końcówki do pipet z dużym otworem	Fischer Naukowy	Numer katalogowy: 02-707-134
Metyloceluloza	Millipore Sigma	Zobacz materiał M0512
Szkiełka mikroskopowe	Fischer Naukowy	Numer katalogowy: 12-553-10
Mopy	Fischer Naukowy	Zobacz materiał BP308-100
nitroceluloza	Branże badawcze Ladd	Numer katalogowy 10800
Żyletki	Magazyn biurowy	397492
Rodamina-falloidyna	ThermoFisher Naukowy	Czynnik chłodniczy R415	Bulion można rozcieńczyć w 100% metanolu do końcowego stężenia 200 μM.
Naczynie do hodowli tkankowych - test ślizgowy	Corning	353025	Każde naczynie do hodowli tkankowej może pomieścić około dziewięciu szkiełek nakrywkowych.
Końcówki do pipet o gładkich ściankach 200 μl	Thomas Naukowy	Numer katalogowy: 1158U38
sprzęt
wirówka	ThermoFisher Naukowy	75006590
mikroskop	Nikon	Model: Eclipse Ti z systemem H-TIRF z obiektywem 100x TIRF (brak 1,49)
Kamera mikroskopowa	Andor	Model: Kamera iXon DU888 EMCCD (format czujnika 1024 x 1024)
Mikroskopowa skrzynka kontrolna	HIT Tokai	Niestandardowy Thermobox
Jednostka laserowa mikroskopu	Nikon	Czteroczęściowy zespół laserowy LU-n4 z laserami półprzewodnikowymi dla 405 nm, 488 nm, 561 nm i 640 nm
Ultrawirówka stołowa Optima Max-XP	Beckman Coulter	393315

(wersja angielska) powiedział: powiedział: powiedział: TGL TGL środowiska