Test bioreporterowy: czuła technika wykorzystująca bioluminescencyjny system reporterowy do wykrywania przeciwciał SARS-CoV-2

Streszczenie

Źródło: Rezaei, R. et al., Wykrywanie przeciwciała domeny wiążącej receptor SARS-CoV-2 przy użyciu bioreportera opartego na HiBiT. J. Vis. Exp. (2021)

W tym filmie pokazujemy test oparty na systemie bioreporterowym HiBit-RBD do wykrywania przeciwciał neutralizujących SARS-CoV-2. System ten celuje w domenę RBD wirusa za pomocą bioluminescencyjnego systemu reporterowego zawierającego HiBiT połączony z domeną RBD.

Protokół

1. Wykrywanie przeciwciał anty-RBD za pomocą szybkiego i czułego testu

1. Test wykrywania przeciwciał HiBiT-RBD
   1. Przygotuj HiBiT-RBD bioreporter.
      nuta: Zaleca się stosowanie supernatantu do poniższego testu, ponieważ jest on łatwiejszy do pobrania i zawiera dojrzałą glikozylowaną wersję białka. Co więcej, lizat zawiera kilka innych białek, które mogą zakłócać interakcję HiBiT-RBD-przeciwciało.
   2. Połączyć 50 μl supernatantu zawierającego HiBiT-RBD z 1 μg komercyjnego przeciwciała SARS-CoV-2-RBD w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml. Do roztworu dodać 20 μl białka wiążącego immunoglobuliny (białka G). Zwiększyć całkowitą objętość do 300 μl, dodając PBS.
      nuta: Całkowita objętość mieszaniny może być zmniejszona do 150 μl. Mniejsze objętości całkowite nie są zalecane, ponieważ może to spowodować nieodpowiednie wymieszanie przeciwciał z bioreporterem.
   3. Inkubować probówkę (probówki) na wytrząsarce probówkowej lub rotatorze przez 30 minut. Wirować przy 12 000 x g przez 30 s, odrzucić supernatant i przemyć PBS. Powtórz proces trzy razy, aby usunąć wolny HiBiT-RBD. Zawiesić ponownie w 50 μl PBS i przenieść na płytkę 96-dołkową.
   4. Dodaj 50 μL 1x LgBiT i odczekaj 5 minut. Następnie dodaj 50 μl 1x substratu NanoLuc. Natychmiast odczytaj sygnał luminescencyjny za pomocą luminometru.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ręczna myjka magnetyczna Bio-Plex	Bio-Rad	171020100	urządzenie
System oznaczania lucyferazy Dual-Glo	Preparat Promega	E2940	Zestaw 100 ml
LgBiT powiedział:	Preparat Promega	N3030	Zestaw do testów
Koraliki magnetyczne Pierce Protein G	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 88848	Test
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Przeciwciało neutralizujące kolce, mysz Mab	SinoBiological	40592-MM57	Test
Czytnik mikropłytek Synergy Mx	BioTek		96-dołkowy luminometr czytnika płytek

powiedział: powiedział: