$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Hodowla ludzkich komórek nabłonka rogówki
- Hoduj unieśmiertelniony HCEC w pokrytych kolagenem kolbach o powierzchni 75 cm² z 20 ml zmodyfikowanej mieszanki pożywki Eagle i składników odżywczych F-12 firmy Dulbecco (DMEM/F12) zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
UWAGA: Potrząsanie nie jest wymagane.
- Zmieniaj nośnik co 2-3 dni.
2. Przygotowanie komórek do testowania
- Po tym, jak komórki prawie się zlewają, usuń pożywkę hodowlaną.
- Dodać 4−6 ml roztworu dysocjacyjnego komórek do każdej kolby o powierzchni 75 cm². Inkubować komórki w temperaturze 37 °C aż do oderwania się komórek (około 20-30 min), okresowo sprawdzając pod mikroskopem.
- Dodać 2−6 ml DMEM/F12 zawierającego 10% FBS do każdej kolby o powierzchni 75 cm².
- Przenieść zawartość kolby do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
- Odwirować komórki przy 450−500 x g przez 5 min. Odpipetować supernatant i ponownie zawiesić komórki w podgrzanym pożywce.
- Policz komórki za pomocą hemocytometru. Oblicz objętość nośnika, który zawiera łącznie 1 x 105 komórek.
- Dodaj 1 x 105 komórek do każdej studzienki 48-dołkowej płytki hodowlanej pokrytej kolagenem-1. Dodaj tyle pożywki do studzienki, aby końcowa objętość pożywki w studzience wynosiła 0,5 ml kultury DMEM/F12 z 10% FBS.
UWAGA: Preparat sztucznego łzy może powodować cytotoksyczność, którą można zmierzyć poprzez zmniejszenie aktywności metabolicznej HCEC. Spójność danych zależy od dodania tej samej liczby HCEC do każdego dołka podczas wysiewu. Stężenie kultury zalecane dla płytek 48-dołkowych wynosi 1 x 105. Ponieważ komórki ssaków mogą osadzać się w probówce wirówkowej po ponownym zawieszeniu, zaleca się częste zawieszanie komórek przez mieszanie podczas wysiewania płytek z komórkami, tak aby zawiesina komórkowa miała równomiernie rozłożony HCEC.
- Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.
3. Brak protokołu osuszania
- Procedura kontrolna
- Po 24 godzinnej inkubacji usunąć pożywkę hodowlaną z płytki.
- Natychmiast poddać działaniu 150 μl preparatu testowego i roztworu kontrolnego pożywki.
- Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 30 minut.
- Usuń roztwory testowe z komórek.
- Dodaj 0,5 ml 10% metabolicznego roztworu barwnika, aby przetestować aktywność metaboliczną. Inkubować komórki przez kolejne 4 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Po 4-godzinnym okresie inkubacji usunąć 100 μl metabolicznego roztworu barwnika z każdej studzienki i umieścić każde 100 μl w studzience z 96-dołkową płytką.
- Zmierz fluorescencję każdej studzienki za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych (Tabela materiałów). Ustaw długość fali wzbudzenia na 540 nm, a długość fali emisji na 590 nm.
- Brak protokołu osuszania (procedura odzyskiwania)
- Powtórz kroki 3.1.1−3.1.4.
- Dodaj 0,5 ml pożywki DMEM/F12 do każdej studzienki.
- Inkubować jeden zestaw kultur przez 18 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Usuń pożywkę i dodaj 0,5 ml 10% metabolicznego roztworu barwnika. Powtórz kroki 3.1.6 i 3.1.7.