Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Ocena skuteczności hamowania związków chemicznych przeciwko wzrostowi Toxoplasma
UWAGA: Tutaj jako przykład przedstawiono ocenę hamowania LHVS we wzroście Toxoplasmy. Testuje się osiem różnych stężeń LHVS i przeprowadza się trzy kontrpróby techniczne dla każdej z trzech kontrprób biologicznych zarówno dla szczepów RHΔku80::NLuc, jak i RHΔku80Δcpl::NLuc.
- Przed zakażeniem pasożytem HFF należy wysiać HFF do 96-dołkowych mikropłytek w formacie trzech rzędów i dziewięciu kolumn na jeden kontratlet biologiczny na związek na szczep. Komórki gospodarza będą mogły rosnąć przez co najmniej 7 dni przed użyciem.
- Przepuszczaj pasożyty RHΔku80::NLuc i RHΔku80Δcpl::NLuc przez 2 dni przed użyciem.
- Przekaż pasożyty Toxoplasma do zbiegających się HFF na 2 dni przed użyciem, przenosząc ~0,3-0,4 ml w pełni zlizowanych pasożytów do kolby T25. Inkubować zakażone komórki gospodarza w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 2 dni.
- Przetrzytrzyj strzykawkę 5 ml świeżo zmielonych pasożytów przez bezpieczną igłę 21 G 5x, aby uwolnić pasożyty wewnątrzkomórkowe, a następnie przepuść przez filtr 3 μm w celu usunięcia resztek komórek gospodarza. Wypłukać resztki pasożytów z kolby przy użyciu 7 ml pożywki D10 wolnej od czerwieni fenolowej, a następnie ponownie przepuścić przez filtr.
- Odwirować pasożyty w temperaturze 1000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT). Odlać supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml pożywki D10 wolnej od czerwieni fenolowej.
- Policz pasożyty za pomocą hemocytometru, aby określić stężenie.
- Rozcieńczyć pasożyty do 1 x 104 pasożytów/ml dla szczepu typu dzikiego (WT). W przypadku szczepów pasożytów z niedoborem wzrostu, należy odpowiednio zwiększyć stężenie, aby zaobserwować znaczny wzrost sygnałów lucyferazy.
- Zawiesić pasożyty w pożywce wolnej od czerwieni fenolowej w stężeniu 1 x 104 pasożyty/ml.
- Odessać pożywkę z płytki zawierającej zbiegające się HFF i zaszczepić każdą studzienkę 150 μl zawiesiny pasożyta. Inkubować mikropłytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 4 godziny.
- Przygotować LHVS w ośmiu różnych stężeniach w 12-dołkowym zbiorniku przez seryjne rozcieńczanie. Ogólnie rzecz biorąc, stężenia są zmniejszane trzykrotnie w sposób seryjnego rozcieńczania.
nuta: Najniższe stężenie jest zmniejszone 6 561-krotnie w stosunku do najwyższego stężenia. Krotna zmiana rozcieńczenia może być odpowiednio dostosowana w oparciu o różne właściwości poszczególnych związków.
- Po 4 godzinach od zakażenia odessać pożywkę w celu usunięcia niezaatakowanych pasożytów i wypełnić każdą studzienkę z kolumn 2-9 150 μl pożywki uzupełnionej LHVS w różnych stężeniach. Pozostawić pierwszą kolumnę wypełnioną zwykłą pożywką, aby służyła jako kontrola niepoddawana działaniu substancji.
- Inkubować mikropłytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez dodatkowe 96 godzin.
- Ostrożnie odessać pożywkę z dołków, aby usunąć niezaatakowane pasożyty, a następnie napełnić studzienki pożywką wolną od czerwieni fenolu RT w każdym rzędzie (z wyjątkiem pierwszego rzędu).
- Wymieszać równe objętości PBS i 2x bufor do oznaczania lucyferazy i rozcieńczyć substrat lucyferazy do 12,5 μM.
- Dodaj 100 μl rozcieńczonego substratu lucyferazy do każdego dołka w górnym rzędzie. Inkubować mikropłytki w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby umożliwić pełnej lizie komórek.
- Zmierz aktywność lucyferazy w poszczególnych studzienkach.
- Uśrednić aktywność lucyferazy trzech technicznych powtórzeń ze studni o każdym indywidualnym stężeniu LHVS.
- Podziel średnią aktywność lucyferazy dla każdego stężenia LHVS przez średnią aktywność lucyferazy pochodzącą od nieleczonych pasożytów, aby obliczyć znormalizowaną aktywność lucyferazy w procentach.
- Wykreślić znormalizowane aktywności lucyferazy w stosunku do poszczególnych stężeń LHVS za pomocą oprogramowania do tworzenia wykresów (ryc. 1). Hamowanie pirymetaminy przeciwko wzrostowi pasożytów jest również mierzone jako kontrola. Pirymetamina jest antybiotykiem klinicznym stosowanym w leczeniu ostrej toksoplazmozy poprzez hamowanie metabolizmu kwasu foliowego w toksoplazmie.
- Oblicz wartości IC50 dla poszczególnych związków za pomocą metody wbudowanej w oprogramowanie do tworzenia wykresów, znormalizowana odpowiedź vs. [inhibitor], w ramach programu regresji "dawka-odpowiedź-hamowanie". IC50 oblicza się według następującego wzoru:
Y = 100/(1 + X/IC50)
gdzie: Y reprezentuje znormalizowaną aktywność lucyferazy zakażonych komórek przy różnych stężeniach inhibitora, a X reprezentuje indywidualne stężenia inhibitora.
