Test β-galaktozydazy do oceny cytotoksyczności wywołanej lekiem u pasożytów

Streszczenie

Źródło: Alonso, V. L. et al. In vitro Badania przesiewowe leków przeciwko wszystkim etapom cyklu życia Trypanosoma cruzi przy użyciu pasożytów eksprymujących β-galaktozydazę. J. Vis. Exp. (2021)

W tym filmie opisujemy prostą i solidną metodę określania potencjału cytotoksycznego leku trypanobójczego przeciwko pasożytowi, Trypanosoma cruzi, wyrażającemu enzym β-galaktozydazy. β-galaktozydaza służy jako wskaźnik lizy komórek, a jej aktywność może być wykorzystana do oceny efektów działania leku.

Protokół

1. Test β-galaktozydazy

UWAGA: Kwantyfikacja aktywności β-galaktozydazy jest używana jako pośredni sposób określania liczby pasożytów. Oczekuje się, że wzrost zostanie zahamowany w obecności związku trypanobójczego, co doprowadzi do mniejszej liczby pasożytów w porównaniu z nieleczoną kontrolą, co znajdzie odzwierciedlenie w niższej aktywności β-galaktozydazy, a tym samym niższej absorbancji.

1. Inkubuj pasożyty za pomocą BZN
   1. Dodać 100 μl odpowiedniego 2x roztworu benznidazolu (BZN) na studzienkę, aby osiągnąć końcowe stężenie BZN 80, 40, 20, 10, 5 i 2,5 μM do 100 μl zawiesiny epimastigoty, komórek Vero z amastigotami (2 dni po zakażeniu) lub trypomastigotów w 96-dołkowej płytce.
   2. Inkubować epimastigoty w temperaturze 28 °C przez 72 godziny, a trypomastigoty lub zakażone komórki Vero z amastigotami przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO₂,
      nuta: Każde stężenie leku powinno być oceniane co najmniej w trzech egzemplarzach i obejmować hodowle kontrolne epimastigotów, trypomastigotów i zakażonych komórek Vero dimetylosulfotlenkiem (DMSO).
2. Reakcja kolorymetryczna
   1. Po okresie inkubacji poddawania działaniu substancji, jeśli zakażone komórki Vero lub trypomastigoty znajdują się w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco z czerwienią fenolową, należy zastąpić pożywkę 100 μl 1x PBS, aby uniknąć zakłóceń. Wykonać trzykrotne studzienki ślepe zawierające tylko 100 μl odpowiedniego podłoża (lub 1 x PBS, w zależności od przypadku).
      nuta: Nie jest konieczne usuwanie pożywki hodowlanej dla epimastigotów w przypadku pożywki LIT lub DMEM bez czerwieni fenolowej. DMEM z czerwienią fenolową może być nadal stosowany; przygotować ślepą próbę z samym DMEM w celu zmierzenia absorbancji zasady, a następnie odjąć tę wartość podczas analizy danych. Pożywka owadzi Schneidera, która jest bezbarwna, jest alternatywą dla epimastigotów.
   2. Do każdej studzienki dodać 40 μl roztworu substratu czerwonego β-D-galaktopiranozydu chlorofenolu (CPRG) i 10 μl roztworu detergentu, uzyskując końcowe stężenie 200 μM CPRG i 0,1% detergentu w końcowej objętości 250 μl w każdym dołku.
      nuta: Roztwór CPRG i detergent można dodać razem w końcowej objętości 50 μl na studzienkę.
   3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny i mierzyć absorbancję przy długości fali 595 nm w spektrofotometrze mikropłytkowym.
      nuta: Oczekiwana zmiana koloru jest od żółtego do czerwonawo-brązowego po rozszczepieniu enzymatycznym β-galaktozydazy (ryc. 1A). Czas inkubacji można wydłużyć do 4 godzin, a widma absorbancji czerwieni chlorofenolowej można odczytać w zakresie od 570 do 595 nm przy podobnym dopasowaniu krzywej. Inkubacja trwająca do 24 godzin w obecności substratu CPRG wykazała podobne dopasowania krzywych.

Wyniki

Rysunek 1: Obliczanie wartości IC50 benznidazolu dla epimastigoty z postaci Dm28c. (A) 96-dołkowa płytka z epimastigotami potraktowanymi różnymi stężeniami BZN (2,5, 5, 10, 20, 40 i 80 μM) przed dodaniem CPRG (1), po wstępnym dodaniu CPRG i detergentu (2) oraz po inkubacji z CPRG i detergentem wykazującymi zmianę koloru (3). (B) Wykres XY logarytmicznych stężeń BZN ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płytki 96-dołkowe	Corning	Numer katalogowy: 3599
Benznidazol	Sigma Aldrich	419656
5 ml sterylna pipeta serologiczna	Jet Biofil	GSP010005
10 ml sterylna pipeta serologiczna	Jet Biofil	GSP211010
Szafa bezpieczeństwa biologicznego	Telstar	Bio II A/P
Pociąg CPRG	Roche	10 884308001	Chlorofenol czerwony-β-D-galaktopiranozyd
DMEM, Wysoki poziom glukozy	Thermo Fisher Cientific	12100046	proszek
Dmso	Sintorgan powiedział:	SIN-061	Dimetylosulfotlenek
Surowica cielęca płodu	Internegocios SA	FCS FRA 500	Sterylne i inaktywowane termicznie
Komórki Vero	Kontroler ATCC (Kontroler T	CRL-1587 (wersja cr
Spektrofotometr mikropłytkowy	Biotek	Synergia HTX
Probówka do mikrowirówek 1,5 ml	Tarson powiedział:	500010-N
G418 roztwór soli dwusiarczanowej	Roche	G418-RO	Stężenie podstawowe: 50 mg/ml

TGL powiedział: )