Test śmierci neuronalnej w celu oceny śmierci komórki w modelu padaczki ex vivo

Streszczenie

Źródło: Carvalho, M., et al., Model epileptogenezy w organotypowych kulturach warstwowych kory nosa i hipokampa. J. Vis. Exp. (2021)

Ten film demonstruje technikę oceny śmierci neuronów w wycinkach organotypowych kory nosowej i hipokampa. Śmierć neuronów następuje w wyniku ewoluujących napadów padaczkowych – przypominających padaczkę in vivo – i jest wykrywana poprzez podwójne barwienie martwych komórek za pomocą jodku propidyny i immunofluorescencji.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie plastrów kory nosowej i hipokampa

UWAGA: Do przygotowania wycinków kory nosowej i hipokampa używa się szczurów P6-7 Sprague-Dawley.

1. Konfiguracja kultury i przygotowanie podłoża
   1. W dniu poprzedzającym hodowlę należy przygotować wymagane podłoża i umieścić je w temperaturze 4 °C.
   2. Przygotuj pożywkę preparacyjną: 25 mM glukozy w zrównoważonym roztworze soli Geya (GBSS).
   3. Przygotuj pożywkę: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% surowica końska (HS), 25 mM glukozy, 30 μg/ml Gentamycyny.
   4. Przygotuj pożywkę podtrzymującą: Neurobaseal-A (NBA), 2% B27, 1 mM L-glutamina, 30 μg/ml gentamycyny, HS (15%, 10%, 5% i 0%).
2. Pobieranie mózgów
   1. Tuż przed rozpoczęciem hodowli dodać 1,1 ml pożywki do każdego dołka płytki 6-dołkowej za pomocą pipety P1000 i umieścić ją w temperaturze 37 °C.
   2. Umieść cały sprzęt (mikroskop preparacyjny, rozdrabniacz tkanek, lampę sekcyjną, narzędzia preparacyjne, elektrody, płytki, wkładki i bibuły filtracyjne) w komorze bezpieczeństwa biologicznego i sterylizuj w świetle UV przez 15 minut.
   3. Dostosuj grubość plastra do 350 μm.
   4. Wyjmij GBSS z lodówki. Dodaj 5 ml GBSS do sześciu szalek Petriego. Na jedno zwierzę przypada sześć szalek Petriego.
   5. Poddaj eutanazji szczeniaka szczura. Wykonaj dekapitację za pomocą ostrych nożyczek u podstawy pnia mózgu zwierzęcia.
   6. Umyj głowę zwierzęcia trzy razy w zimnym GBSS i zabierz ją do szafki bezpieczeństwa.
3. Izolacja tkanek i przygotowanie plastrów
   1. Mocno włóż ostre kleszcze do oczodołów, aby przytrzymać głowę.
   2. Cienkimi nożyczkami przetnij skórę/skórę głowy wzdłuż linii środkowej, zaczynając od otworu kręgowego w kierunku płatów czołowych i odłóż na bok.
   3. Przeciąć w ten sam sposób czaszkę i wzdłuż poprzecznej szczeliny mózgowej (przestrzeń między mózgiem a móżdżkiem). Za pomocą zakrzywionych długich kleszczy rozsuń go.
   4. Wyrzuć opuszki węchowe szpatułką. Usuń mózg z głowy i umieść go w lodowatym GBSS z powierzchnią grzbietową skierowaną do góry (ryc. 1A).
   5. Włóż cienkie kleszcze do móżdżku i idź wzdłuż linii środkowej, a szpatułka bardzo ostrożnie otwiera każdą półkulę (ryc. 1B).
   6. Za pomocą kleszczyków o krótkiej krzywiźnie ostrożnie usuń nadmiar tkanki pokrywającej hipokamp, nie dotykając struktury hipokampa. Następnie za pomocą szpatułki przeciąć poniżej każdego hipokampa (ryc. 1C).
   7. Podnieś jedną półkulę i umieść ją hipokampem skierowanym do góry na bibule filtracyjnej. Powtórz procedurę z drugą półkulą i umieść ją równolegle do pierwszej, w bibule filtracyjnej. Umieść bibułę filtracyjną na rozdrabniaczu tkanek, tak aby półkule były prostopadłe do ostrza, i pokrój półkule na plastry o grubości 350 μm (ryc. 1D).
   8. Umieść pokrojoną tkankę na szalce Petriego z zimnym GBSS (ryc. 1E).
   9. Ostrożnie oddziel plastry za pomocą elektrod z okrągłą końcówką (Rysunek 1F). Zachowaj tylko plastry z nienaruszoną strukturalnie korą nosa i hipokampem. Obszary DG i CA powinny być idealnie zdefiniowane, podobnie jak kora śródwęchowa i okołęchowa (ryc. 1G).
   10. Umieść każdy plasterek na wkładce (Rysunek 1H-I) za pomocą szpatułki i elektrody z okrągłą końcówką. Usuń nadmiar pożywki preparacyjnej wokół każdej plastry za pomocą pipety P20 (Rysunek 1J). Cztery wycinki kory nosowej i hipokampa można hodować w jednej wkładce (ryc. 1K).
4. Utrzymanie kultury
   1. Zmieniaj podłoże co drugi dzień.
   2. Rozgrzać podłoże w temperaturze 37 °C.
   3. Wyjmij płytki z inkubatora. Podnieś każdą wkładkę, przytrzymując plastikową krawędź kleszczykami (Rysunek 1L).
   4. Użyj wolnej ręki, aby zassać podłoże ze studni. Umieścić wkładkę z powrotem w studzience i dodać 1 ml za pomocą pipety P1000 świeżego podgrzanego podłoża (ryc. 1M). Powtórz tę czynność dla wszystkich wkładek. Upewnij się, że między membraną a medium nie są uwięzione pęcherzyki powietrza.
      nuta: Plastry podobne do epilepsji ulegają stopniowemu i kontrolowanemu pozbawianiu surowicy w pożywce. Począwszy od 9 Days In Vitro (DIV), slices są utrzymywane w NBA bez HS.

2. Test wychwytu PI

UWAGA: Śmierć komórki była oceniana poprzez monitorowanie wychwytu przez komórki barwnika fluorescencyjnego jodku propidyny (PI). PI jest związkiem polarnym, który wnika do komórek z uszkodzonymi błonami komórkowymi i oddziałuje z DNA emitując czerwoną fluorescencję (absorbancja 493 nm, emisja 630 nm). Ponieważ PI nie jest przepuszczalny dla żywych komórek, służy do wykrywania martwych komórek w populacji.

1. Inkubacja PI
   1. Przygotować w pożywce świeże rozcieńczenie PI w stosunku 1:10.
   2. W celu wykonania testu wychwytu PI wyjmij płytkę z inkubatora i ostrożnie podnieś wkładkę. Dodać 13 μl PI do pożywki za pomocą pipety P20, uzyskując końcowe stężenie 2 μM. Powoli mieszać płytkę przed ponownym włożeniem wkładki na miejsce. Upewnij się, że pod plastrami nie ma bąbelków.
   3. Umieść plastry z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 2 godziny.
   4. Postępuj zgodnie z protokołem immunohistochemicznym, jak opisano w następnym rozdziale. Przykryj płyty aluminium, ponieważ PI jest wrażliwy na światło.

3. Immunohistochemia

UWAGA: W immunohistochemii, przeciwciało specyficzne dla neuronu, jak również przeciwciała zdolne do rozróżniania spoczynkowych i reaktywnych fenotypów mikrogleju i astrocytów, zostały użyte do oceny stopnia śmierci neuronów i glejozy w organotypowych warstwach organotypowych przypominających korę nosa i hipokamp

.

1. Utrwalanie tkanek
   1. Wyjąć płytkę z inkubatora i zassać pożywkę. Utrwal plastry 4% paraformaldehydem (PFA) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, dodając 1 ml PFA poniżej i powyżej plastrów za pomocą pipety P1000.
   2. Usuń PFA i dodaj 1 ml PBS. Dodaj również PBS poniżej i powyżej plasterków.
   3. Przechowywać plastry w temperaturze 4 °C, w PBS, do czasu dalszego użycia. Zawsze umieszczaj parafilm wokół płytek, aby uniknąć wyschnięcia.
2. Etapy barwienia immunologicznego
   1. Umyj dwukrotnie, za każdym razem po 10 minut, 1 ml PBS.
   2. Przygotować roztwór przepuszczalny/blokujący zawierający 1% Triton-X100, 10% HS i 10% BSA w PBS. Przygotuj 5% roztwór BSA.
   3. Narysuj dwa prostokąty za pomocą pisaka hydrofobowego (Rysunek 2A). Wytnij plastry z wkładki (Rysunek 2B) bardzo ostrym ostrzem. Umieść dwie kromki na szkiełku (Rysunek 2C) i dodaj 140 μl roztworu przepuszczalnego/blokującego na wierzch każdej plastry, używając pipety P200. Inkubować przez 3 godziny w temperaturze pokojowej.
   4. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała do rozcieńczenia roboczego w 5% BSA w PBS. Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze 4 °C.
   5. Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Od tego kroku należy chronić płytkę przed światłem, ponieważ pracuje się z fluoroforami.
   6. Umieść 50 μl kropli roztworu Hoechst na wierzchu każdego plasterka i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
   7. Myć między inkubacjami. Zawsze myj trzy razy, za każdym razem przez 10 minut, za pomocą PBS-T.
   8. Usuń Hoechst i umyj zgodnie z zaleceniami.
   9. Dodaj 50 μl podłoża montażowego na wierzch każdego plasterka. Przykryj szklanym szkiełkiem nakrywkowym i otocz lakierem do paznokci (ryc. 2D).
   10. Pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 24 godziny.
   11. Wizualizuj barwienie immunologiczne pod mikroskopem konfokalnym. Poplamione plastry przechowywać w temperaturze -20 °C.

Wyniki

Rycina 1: Szczegółowa procedura przygotowania wycinków organotypowych z kory nosa i hipokampa. (A) Usuń mózg z głowy i umieść go w lodowatym GBSS z powierzchnią grzbietową skierowaną do góry. (B) Włóż kleszcze do móżdżku. Otwórz mózg przez linię środkową i usuń nadmiar tkanki nad hipokampem. (C) Za pomocą szpatułki naciętej poniżej hipokampa, jak wskazują strzałki. (D

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówka wirówkowa 50 ml, stożkowe dno	Corning	430829
70% etanolu	Manuel Vieira, Lda	UN1170
Anty-NeuN (królik)	Werfen	Numer katalogowy: 16712943S	Rozcieńczyć w stosunku 1:500
Suplement B-27™ (50X), bez surowicy	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 17504-044
Ostrza do rękojeści skalpela	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 10011-00
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	NZYTech	MB04602	5% BSA służy do rozcieńczania przeciwciał pierwszorzędowych. Dodaj 0,5 g BSA do 10 ml PBS.
System komór do wycinania mózgu/tkanek	Instrumenty Warnera
Wkładki do hodowli komórkowych, 30 mm, hydrofilowy PTFE	Millipore SAS	PICM03050
Zimne źródło światła	Schott	KL 300 LED
Konfokalny mikroskop laserowy	Zeiss	Zobacz materiał LSM 710
Konwencjonalny inkubator	Thermo Scientific Heraeus	BB15, Linia funkcyjna	Ustawione na 37 °C i 5% CO2
D(+)-Glukoza jednowodna	Merck Millipore	1.08342.1000
D-(+)-Roztwór glukozy, 45% w wodzie	Sigma	G8769
wodorofosforan sodu dwuwodny	Merck Milipore	1.06580.1000
Mikroskop preparacyjny/lupa	MEIJI TECHNO CO. LTD	122285
IgG (H+L) przeciwko oślikom w sprzężeniu z Alexa Fluor 488	Invitrogen	Nr kat. A21206	Rozcieńczyć w stosunku 1:500
Dumont #5 Kleszcze drobne Biologie Inox	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 11254-20
Kleszcze Dumont #5 Standard Inox	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 11251-20
Dumont #7 Kleszcze Standard Dumoxel	Narzędzia naukowe	Rozdział 11271-30
Dumont Medical #7S Kleszcze Short Curve Inox	Narzędzia naukowe	Rozdział 11273-22
Roztwór podstawowy gentamycyny, 50 mg/ml	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 15750-037
Zrównoważony roztwór soli Geya (GBSS)	Przemysł biologiczny	01-919-1A
Elektrody szklane	Produkty naukowe	Zobacz materiał GB150F-10	Okrągłe końcówki domowej roboty
Szklane pipety Pasteura, 230 mm	VWR Polska	612-1702
Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS)	Thermo Fisher Naukowy	24020-091
Surowica dla koni, inaktywowana termicznie (HS)
kwas solny	Thermo Fisher Naukowy	26050-088
Długopis hydrofobowy	Merck Milipore	1.09057.1000
INCU-Line IL10	Dako Dako	S200230-2
Szpatułka tęczówki zakrzywiona	Instrumenty Warnera	BSC-HT Haas Góra
Szafa bezpieczeństwa biologicznego Labculture klasy II	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 10092-12
Papier do czyszczenia soczewek	HERASafe	Zobacz materiał HS 12
L-glutamina, roztwór 200 mM (Q)	TIFFEN
Mikroprobówka 0,5 mL, PP	Merck Millipore	1.05886.0500
Mikroprobówka 1,5 mL, PP	SARSTEDT (w	72 699
Mikroprobówka 2,0 mL, PP	SARSTEDT (w	72.690.001
Okulary nakrywkowe Miroscope, 24 mm x 60 mm	Instrument Suttera	Zobacz materiał MP-285
lakier do paznokci	Lotnisko Marienfeld	102242
Neurobaseal-A Medium (NBA)	Banał
Opti-MEM® I Pożywka o obniżonej surowicy	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy 10888-022
Paraformaldehyd, proszek	Thermo Fisher Naukowy	31985-047
Pompa perystaltyczna	Firma VWR Chemicals	2 87 94 295
Bufor fosforanowo-solny (PBS)	Gilson	Zobacz materiał M312
Wzorcowe roztwory fosforanów, PO43- w wodzie			domowej roboty. PBS z 0,5% Tween-20 (PBS-T) służy do mycia plastrów podczas testu immunohistochemicznego.
Zestaw pipet	BDH ARISTAR	452232C
Platyna 5 ostrzy	Gilson	P2, P10, P20, P100, P200, P1000
Jodek propidyny (PI)	Sigma-Aldrich	P5405-250g
Bibuła filtracyjna jakościowa, celuloza, klasa 1, 55 mm	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P4170-25MG	Roztwór podstawowy o stężeniu 1 mg/ml w wodzie.
Bibuła filtracyjna jakościowa, celuloza, klasa 1, 90 mm	Whatman	Numer katalogowy: 1001-055	Średnia retencja 11μm
Rękojeść skalpela	Whatman	Numer katalogowy: 1001-090	Średnia retencja 11μm
Strzykawka insulinowa z końcówką bez igły 1 ml	Narzędzia naukowe	Zobacz materiał 91003-12
Nożyczki studenckie proste ostreSharp 12cm	Grupa produktów Astro Med Inc GRASS	Stymulator S48
Prowadnice adhezyjne SuperFrost Plus™	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 91402-12
Sterylne naczynie do hodowli tkankowych 60 x 15 mm z powłoką TC	Thermo Fisher Naukowy	J1800AMNZ
Sterylne płytki 6-dołkowe z powłoką TC	Corning	CORN430166
Rozdrabniacz tkanek	SYSTEMY MEDYCZNE CORP.	TC-102
Tryton X-100	Mickle Laboratory Engineering CO. LTD.	MTC/2	Ustawione na 350 μm
Tween-20 (Kanał Telewizyjny)	BDH (Międzynarodowa Organizacja T	Numer katalogowy: 14630
	Sigma	Zobacz materiał P2287

powiedział: powiedział: powiedział: TGL języku angielskim) osób języku angielskim) TGL powiedział: