1. Hodowla komórkowa
- Utrzymuj komórki w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 i hodowli za pomocą DMEM uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) (komórki HeLa i A431) lub RPMI uzupełnionym 15% FBS (komórki U266B1). Hoduj komórki, aż osiągną 70-80% konfluencji, a następnie trypsynizuj je i pasażuj lub użyj do testów.
nuta: Pożywki hodowlane zawierały czerwień fenolową. Nie przeprowadzono głodu surowicy dla żadnej linii komórkowej przed przeprowadzeniem testów.
2. Miareczkowanie stymulatora lub inhibitora przy użyciu protokołu testu dwupłytkowego z przylegającymi komórkami
UWAGA: Ta procedura opisuje, jak określić moc stymulatora lub inhibitora poprzez wygenerowanie krzywej stężenie-odpowiedź z serii rozcieńczeń badanego związku.
- Wysiewanie komórek
- Dozować 50 μl komórek o wstępnie zoptymalizowanej gęstości (40 000 komórek HeLa / basenik zarówno dla STAT3, jak i STAT6; 75 000 komórek A431 / basenik dla STAT5) na 96-dołkową płytkę poddaną działaniu kultur tkankowych w odpowiednim pożywce hodowlanej. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C/5% CO2,
nuta: Należy określić optymalną gęstość komórek i czas inkubacji hodowli.
- Rozcieńczenia badanych związków
- Przygotować pośrednią serię 2-krotnego rozcieńczenia badanego związku (związków) poprzez seryjne rozcieńczanie związku (rozcieńczenia w odstępie pół logarytmu) w 12 dołkach 96-dołkowej płytki polipropylenowej do podłoża wolnego od surowicy.
nuta: Zaleca się przeprowadzenie 12-punktowej krzywej stężenie-odpowiedź w odstępie pół logarytmu co najmniej w dwóch egzemplarzach w celu dokładnego oszacowania EC50 lub IC50.
- Alternatywnie, w przypadku hydrofobowych, rozpuszczalnych w dimetylosulfotlenku (DMSO) związków testowych, należy przeprowadzić początkowe rozcieńczenia w 100% DMSO, a następnie rozcieńczyć serię rozcieńczeń związku do podłoża wolnego od surowicy.
nuta: Tolerancja testu na DMSO musi zostać ustalona przed przeprowadzeniem miareczkowania badanego związku w nośniku DMSO. Ważne jest, aby utrzymać równe stężenia rozpuszczalnika między komórkami poddanymi działaniu substancji i niepoddanych działaniu środka. Ponadto, podczas badania seryjnych rozcieńczeń związków, stężenia rozpuszczalników powinny zawsze pozostawać stałe w całej serii rozcieńczeń.
- Leczenie komórkowe
- W celu stymulacji komórek dodać 50 μl pożywki bez surowicy samej (komórki nieleczone) lub zawierającej stymulator (2x).
- Inkubować przez wstępnie zoptymalizowany czas w temperaturze pokojowej (RT) lub 37 °C (interferon (IFN) α2b/20 min w RT dla STAT3; naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)/10 min w RT dla STAT5; interleukina (IL)-4/20 min w RT dla STAT6). Następnie przejdź do sekcji 2.4.
nuta: Należy określić optymalną temperaturę inkubacji.
- W celu zahamowania komórek dodać 25 μl pożywki bez surowicy samej (komórki nieleczone) lub zawierającej inhibitor (4x).
- Inkubować przez wstępnie zoptymalizowany czas w temperaturze pokojowej lub 37 °C (inhibitor JAK: 1/30 min w temperaturze pokojowej dla STAT3 i STAT6; Erlotynib/15 min w RT dla STAT5).
- Dodać 25 μl pożywki bez surowicy (komórki niepoddane działaniu surowicy) lub zawierającej stymulator (4x) w temperaturzeEC 80.
- Inkubować przez wstępnie zoptymalizowany czas w temperaturze pokojowej lub temperaturze 37 °C (w takich samych warunkach jak w przypadku kroku 2.3.2).
- Liza komórek
- Przygotuj specjalny zestaw 1x uzupełniony bufor do lizy zgodnie ze wskazaniami producenta.
nuta: Obowiązkowe jest uzupełnienie 1x Lysis Buffer o 100x Koktajl Inhibitorów Fosfatazy rozcieńczony do końcowego stężenia 1x. 1x Suplementowany bufor do lizy zawiera 1 mM fluorku sodu, 2 mM ortowanadanu sodu i 2 mM beta-glicerofosforanu. Inne inhibitory fosfatazy nie są wymagane i należy ich unikać. Nie zaleca się stosowania do lizy i inhibitorów fosfatazy innych niż te zawarte w zestawie, ponieważ mogą one zawierać składniki, które mogą zakłócać pomiar.
- Ostrożnie usunąć i wyrzucić pożywkę do hodowli komórkowych poprzez zasysanie supernatantu.
- Natychmiast dodaj 50 μl 1x Uzupełniony bufor do lizy.
nuta: Objętość buforu do lizy (25-50 μl) można zoptymalizować.
- Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej pod wytrząsaniem (wytrząsarka orbitalna ustawiona na 400 obr./min; umiarkowane mieszanie).
nuta: Czas inkubacji lizy (30-60 min) można zoptymalizować. Lizaty mogą być natychmiast użyte do wykrywania białka docelowego lub zamrożone w temperaturze -80 °C.
- Detekcja TR-FRET
- Przygotuj 4x Mieszaninę do wykrywania przeciwciał w 1x Bufor Detekcyjny zgodnie ze wskazaniami producenta.
- Na tym etapie przenoszenia ostrożnie odpipetować 15 μl lizatu komórkowego z 96-dołkowej płytki hodowlanej do dołka z białą, 384-dołkową mikropłytką o małej objętości.
- Dodać 15 μl lizatu kontroli dodatniej i 15 μl 1x buforu do lizy (kontrola ujemna) do oddzielnych dołków testowych.
- Dodać 5 μl 4x Mieszaniny do wykrywania przeciwciał (Eu-Ab1/FR-Ab2 do wykrywania fosfobiałka lub Eu-Ab3/FR-Ab4 do wykrywania białka całkowitego) do każdej z dołków testowych.
- Przykryć płytkę uszczelniaczem do płytek i inkubować przez 1 godzinę do nocy w temperaturze pokojowej, w zależności od oznaczenia (patrz odpowiednia karta danych technicznych).
nuta: Optymalny czas odczytu musi być zoptymalizowany dla każdego testu i linii komórkowej. Płytkę można kilkakrotnie odczytać bez negatywnego wpływu na wydajność testu.
- Usuń samoprzylepny uszczelniacz do płytek i odczytaj płytkę na czytniku mikropłytek kompatybilnym z TR-FRET.
nuta: Zalecane są fluorometry oparte na filtrach, chociaż można użyć niektórych przyrządów monochromatorowych. Sprawdź, czy zainstalowany jest odpowiedni moduł optyczny (filtry i lustro) dla TR-FRET. Użyj długości fali wzbudzenia 320 lub 340 nm do wzbudzenia chelatu europu. Odczytuj testy zarówno przy 615 nm (lub 620 nm), jak i 665 nm, aby wykryć zarówno emisję z donorowego europu, jak i akceptora fluoroforu. Ustawienia instrumentu będą zależeć od konkretnego czytnika. Przedstawione tutaj dane uzyskano przy użyciu wzbudzenia lampą, opóźnienia 90 μs, czasu całkowania 300 μs i 100 błysków na studzienkę. Test phospho-STAT4 został jednak odczytany przy użyciu wzbudzenia laserowego w celu wygenerowania wyższych stosunków sygnału do tła (S/B).
