<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Szkiełka nakrywkowe 18 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CB00180RA</td>
			<td>Sterylizuj przed użyciem</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalazyna D</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHZ1063</td>
			<td>Rozpuszczony w DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zestaw EndoFree Plasmid Maxi</td>
			<td>QIAGEN powiedział:</td>
			<td>Numer katalogowy: 12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescencyjny nośnik montażowy</td>
			<td>Dako Dako</td>
			<td>S302380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyd</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Zobacz materiał P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>#6084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Certyfikat pCI FE65</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Patrz referencje 8 i 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletki PBS</td>
			<td>Gibco (firma Gibco)</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicylina-Streptomycyna</td>
			<td>Gibco (firma Gibco)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromowodorek poli-D-lizyny</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Zobacz materiał P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>łopatka</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Zobacz materiał S4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa</td>
			<td>Gibco (firma Gibco)</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

test immunofluorescencyjny do oceny wpływu białek docelowych na wzrost neurytów

Źródło: Chan, W., W., R. et al. <a href="https://app.jove.com/v/60031">Ulepszony test oparty na białku zielonej fluorescencji do badania wzrostu neurytów w neuronach pierwotnych.</a> J. Vis. Exp. (2019).
W tym filmie demonstrujemy test immunofluorescencyjny oparty na EGFP, aby zidentyfikować skuteczność docelowych białek na rozrost neurytów pierwotnych neuronów korowych. Pierwotne neurony są transfekowane białkiem fluorescencyjnym, EGFP i białkiem docelowym, a następnie przeprowadza się test immunologiczny w celu zbadania wpływu białka docelowego na wzrost neurytów.

Test immunofluorescencyjny do oceny wpływu białek docelowych na wzrost neurytów

Źródło: Chan, W., W., R. i wsp. Ulepszony test oparty na białku zielonej fluorescencji do badania wzrostu neurytów w neuronach pierwotnych. J. Vis. Exp. 
...

Rozwijające się neurony rozszerzają procesy cytoplazmatyczne ze swoich ciał komórkowych poprzez rozrost neurytów, aby rozwinąć dendryty i aksony, które są niezbędne do komunikacji między neuronami.
Aby zbadać wpływ białka docelowego na wzrost neurytów, należy wziąć płytkę wielodołkową z szkiełkiem nakrywkowym pokrytym poli-D-lizyną u podstawy. Na powierzchni szkiełka nakrywkowego znajduje się przylegająca kultura pierwotnych neuronów korowych pochodzących z embrionalnego mózgu szczura.
Potraktuj neurony mieszanką zawierającą dwa typy plazmidów - plazmid EGFP kodujący wzmocnione białko zielonej fluorescencji i drugi plazmid kodujący białko docelowe w odpowiednim odczynniku do transfekcji.
Odczynnik do transfekcji ułatwia wnikanie plazmidów do komórek.
Po transfekcji oba plazmidy ulegają ekspresji, wytwarzając białka zielonej fluorescencji i białka docelowe. Ekspresja EGFP nadaje zieloną fluorescencję komórkom ulegającym transfekcji.
Białka docelowe o potencjale stymulującym wzrost neurytów inicjują sygnalizację komórkową, która sprzyja reorganizacji cytoszkieletu i prowadzi do rozwoju projekcji neuronalnych i ich rozszerzeń.
Odessać zużyte podłoże i utrwalić komórki paraformaldehydem. Przeciwbarwić komórki za pomocą znakowanych czerwoną fluorescencją przeciwciał przeciwko białku docelowemu, które specyficznie wiążą wyrażone białka docelowe i nadają komórkom dodatkową czerwoną fluorescencję.
Usuń szkiełko nakrywkowe z płytki hodowlanej i obserwuj je pod mikroskopem fluorescencyjnym.
Komórki współtransfekowane wykazujące dwukolorowy sygnał fluorescencyjny wykazują dłuższe procesy neuronalne niż komórki pozbawione czerwonej fluorescencji, co potwierdza stymulujący wpływ białka docelowego na wzrost neurytów.

Po dwóch dniach w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla rozcieńczyć EGFP i plazmidowe DNA z białkiem docelowym oraz odczynnik do transfekcji w dwóch oddzielnych probówkach o pojemności 1,5 mililitra, a następnie wymieszaj je ze sobą. Transfekcja komórek za pomocą konstruktu EGFP poprzez dodanie mieszanki transfekcyjnej do studzienek.
Po 24 godzinach umyj komórki PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza i utrwal je 4% paraformaldehydem w PBS przez 10 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
Pod koniec inkubacji przemyć utrwalone komórki trzy razy świeżym PBS na przemycie i dodać minimalną objętość pożywki do montażu fluorescencji na jednym szkiełku mikroskopowym na próbkę. Następnie ostrożnie przenieś powlekane szkiełka nakrywkowe na podłoże montażowe, tak aby próbki były skierowane w stronę szkiełek podstawowych.
Aby zobrazować wzrost neurytów, wybierz obiektyw 40x w mikroskopie epifluorescencyjnym i kliknij "Start", aby uchwycić obrazy z co najmniej 40 nienaruszonych neuronów EGFP-dodatnich na transfekcję.
Po zobrazowaniu wszystkich nowych praw otwórz przechwycone obrazy w ImageJ za pomocą wtyczki NeuronJ i zmierz długość najdłuższego neurytu każdego neuronu od ciała komórki do czubka stożka wzrostu. Następnie przeanalizuj dane uzyskane za pomocą oprogramowania, aby określić wpływ docelowych białek na wzrost neurytów.

immunofluorescence-assay-to-evaluate-effect-target-proteins-on

Research

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

Techniki biologiczne

Assay Techniques

Techniki analityczne

Immunoassays

Testy immunologiczne

Immunofluorescence Assay to Evaluate Effect of Target Proteins on Neurite Outgrowth

993 Views. Rozwijające się neurony rozszerzają procesy cytoplazmatyczne ze swoich ciał komórkowych poprzez rozrost neurytów, aby rozwinąć dendryty i aksony, które są niezbędne do komunikacji między neuronami. Aby zbadać wpływ białka docelowego na wzrost neurytów, należy wziąć płytkę wielodołkową z szkiełkiem nakrywkowym pokrytym poli-D-lizyną u podstawy. Na powierzchni szkiełka nakrywkowego znajduje się przylegająca kultura pierwotnych neuronów korowych pochodzących ...

Test immunofluorescencyjny do oceny wpływu białek docelowych na wzrost neurytów

W tym artykule

Streszczenie

Oświadczenia

Materiały

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Powiązane artykuły

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szkiełka nakrywkowe 18 mm	Thermo Scientific	CB00180RA	Sterylizuj przed użyciem
Cytochalazyna D	Invitrogen	PHZ1063	Rozpuszczony w DMSO
Zestaw EndoFree Plasmid Maxi	QIAGEN powiedział:	Numer katalogowy: 12362
Fluorescencyjny nośnik montażowy	Dako Dako	S302380
Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P6148
pEGFP-C1	Clontech	#6084-1
Certyfikat pCI FE65			Patrz referencje 8 i 15
Tabletki PBS	Gibco (firma Gibco)	18912014
Penicylina-Streptomycyna	Gibco (firma Gibco)	15140122
Bromowodorek poli-D-lizyny	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P7280
łopatka	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S4147
Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa	Gibco (firma Gibco)	25300062