Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy kropelkowej do wykrywania mutacji indel w genach docelowych

Streszczenie

Źródło: Carballar-Lejarazú, R., et al. Digital-Droplet PCR to Detection Indels Mutations in Genetically Modified Anopheline Mosquito Populations. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film pokazuje rolę cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej w identyfikacji mutacji indel w próbce DNA. Wysoka precyzja i czułość ddPCR umożliwiają dokładne i spójne wykrywanie rzadkich mutacji obecnych w próbce, nawet przy niskich poziomach. Może identyfikować i określać ilościowo mutacje indel w różnych regionach genomu, dostarczając cennych informacji na temat mechanizmów mutacji i funkcjonalnych konsekwencji tych mutacji.

Protokół

1. reakcje ddPCR i przygotowanie do generowania kropel

1. Określ ilościowo DNA za pomocą fluorometru.
   nuta: Do testu drop-off zaleca się użycie zakresu 3 000-30 000 haploidalnych kopii genomu na reakcję, który ma na celu wykrycie zdarzeń NHEJ za pomocą sondy znakującej HEX, która wiąże się z sekwencją WT w docelowym miejscu cięcia i nie ulega wyżarzaniu (odpadaniu), jeśli w miejscu docelowym występuje delecja lub insercja, wskazujące na obecność wariantu NHEJ.
2. Oblicz liczbę kopii, używając haploidalnego genomu, masy i stężenia DNA w ekstrakcie. Odbywa się to poprzez pomnożenie stężenia wyekstrahowanego DNA przez objętość użytą do uzyskania całkowitej masy DNA, a następnie podzielenie go przez masę haploidalnego genomu. Upewnij się, że dodana objętość mieści się w przedziale 1-10 μl. Rozcieńczyć w razie potrzeby, aby znaleźć się w zalecanym zakresie kopii haploidalnego genomu.
   nuta: Szacuje się, że jeden haploidalny genom Anopheles gambiae wynosi 0,27 pg na dorosłego komara.
3. Projektowanie podkładów i sond. Zaprojektuj startery oligonukleotydowe do przodu i do tyłu o temperaturze topnienia startera (Tm) w zakresie 55-60 °C, które otaczają końce 5' i 3' miejsca docelowego gRNA, wytwarzając amplikon 150-400 pz.
   1. Sonda znakowana HEX (heksachlorofluoresceiną) do wykrywania NHEJ: Zaprojektuj oligonukleotyd o długości ~ 15-20 pz komplementarny do miejsca docelowego i dodaj sondę HEX do końca 5' i BHQ1 (BLack Hole Quencher 1) do końca 3'. Tm sondy hydrolizy powinno być o 3-10 °C wyższe niż Tm starterów.
   2. Sonda znakowana FAM (6-karboksyfluoresceiną) w celach informacyjnych WT: Zaprojektuj oligonukleotyd o długości ~ 15-20 pz komplementarny do konserwatywnego miejsca genomu odległego (około 25 pz) od miejsca docelowego i dodaj sondę FAM do końca 5' i BHQ1 do końca 3'. Tm sondy hydrolizy powinno być o 3-10 °C wyższe niż Tm starterów.

2. Przygotowanie reakcji PCR

1. Przygotować 25 μl mieszanki próbek ddPCR z następującymi składnikami: ddPCR supermix dla sond (bez UTP): 12,5 μL, startery do przodu i do tyłu (10 μM): 1 μL każda, sondy HEX/FAM (10 μM): 0,625 μL każda, DNA: 1-5 μL (3 750-37 500 kopii haploidalnego genomu) i woda: do 25 μL.
2. Dokładnie wymieszaj reakcje, pipetując wirowo lub zwrotnie (góra i dół) (20x).
   nuta: Jeśli reakcje zachodzą na 96-dołkowej płytce, należy pipetować całą objętość w górę i w dół 20 razy, zamiast wirować, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków.
3. Krótko odwirować próbki, aby osadzić mieszaninę na dnie probówki lub studzienki.
   nuta: Upewnij się, że reakcje zachodzą w temperaturze pokojowej do wytwarzania kropel. Przygotuj 1x mieszanki ddPCR dla dodatkowych/niewykorzystanych dołków w każdym kartridżu (każdy wkład ma 8 dołków).

3. Generowanie kropel

1. Za pomocą pipety wielokanałowej o pojemności 50 μl załadować 20 μl mieszanki próbek ddPCR do środkowego rzędu wkładu (rysunek 1A, u góry).
2. Załaduj 70 μl oleju do dolnego rzędu. Załaduj 20 μL 1x ddPCR supermix do nieużywanych studzienek.
   nuta: Nie wprowadzaj bąbelków.
3. Umieść uszczelkę tak, aby dotykała tylko krawędzi, unikając środkowego wklęsłego obszaru (Rysunek 1B).
4. Umieść płytkę bezpiecznie w generatorze kropel i zamknij pokrywę, aby rozpocząć bieg.
5. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 40 μl mieszaniny emersyjnej z górnego rzędu wkładu (Rysunek 1A, na dole) do płytki 96-dołkowej.
   1. Pobieraj ciecz przez 3-5 sekund pod kątem 45-30°. Mieszaninę należy wypychać powoli przez ponad 3 sekundy pod kątem 45° na bok studzienki, pozwalając jej spłynąć po boku. Można przejść do drugiego zatrzymania (całkowitego wydalenia) pipety, aby usunąć cały płyn.
6. Za pomocą foliowych zgrzewaczy termicznych zgrzewać płyty przez 5 s w temperaturze 180 °C.

4. PCR

1. Umieść szczelnie zapieczętowaną płytkę w termocyklerze (rysunek 1C) i ustaw zalecane warunki PCR, jeśli postępujesz zgodnie z wytycznymi NHEJ dotyczącymi drop-off, w następujący sposób:
   1. Wstępna denaturacja w temperaturze 95 °C przez 10 min.
   2. Ustaw 40 cykli po 94 °C na 30 s na denaturację, 55 °C na 1 minutę na wyżarzanie i 60 °C na 2 minuty na przedłużenie.
   3. Przechowywać w temperaturze 98 °C przez 10 minut.
   4. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
      nuta: Temperatura wyżarzania dla określonych podkładów i zestawów sond może być zoptymalizowana za pomocą gradientu termicznego. Stosuj szybkość narastania 2 °C/s dla wszystkich etapów. Warunki PCR powinny być dostosowane w zależności od każdego projektu i konfiguracji eksperymentu.

5. Odczyt kropli

1. Umieść płytkę bezpiecznie w czytniku kropel z dołkiem A-1 w lewym górnym rogu (wygładzony róg, pozostałe trzy są obramowane) (Rysunek 1D).
2. Ustaw płytkę w programie: Wyznaczanie FAM jako znanego kanału referencyjnego i HEX jako nieznanego (Rysunek 2A).
3. Przeprowadź eksperyment z czytaniem kropelkowym jako bezpośrednią kwantyfikację. Po zakończeniu przebiegu zmień Typ eksperymentu na Drop-Off (DOF) dla analizy (Rysunek 2A).

Wyniki

Rysunek 1: Konfiguracja i procedura eksperymentalna. (A) Przygotowanie wkładu do wytwarzania kropel. (Góra) Próbki są napełniane w środkowym rzędzie wkładu, podczas gdy olej jest napełniany w dolnym rzędzie. (Na dole) Górny rząd wypełniony zemulgowanymi kropelkami po wytworzeniu kropli. (B) Generator kropel z wkładem wypełnionym próbką i pokryty umieszczoną uszczelk...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki
ddPCR Super Mix dla sond (bez dUTP)	Bio-Rad	1863024
EDTA (pH 8,0)	Invitrogen	AM9260G
Woda klasy PCR			Można używać dowolnej certyfikowanej wody klasy PCR
Proteinaza K 20 mg/ml	Thermo Fisher Naukowy	Zobacz materiał AM2546
Materiałów
Płytka 96-dołkowa ddPCR	Bio-Rad	12001925
Generator kropel DG8 Kartridż i uszczelki	Bio-Rad	1864007
Olej do generowania kropel do sond	Bio-Rad	1863005
Sondy fluorescencyjne (np. sondy FAM/HEX)	Sigma-Aldrich	N/a	Sondy są specyficzne dla eksperymentów i można je kupić u dowolnego dostępnego certyfikowanego sprzedawcy.
Startery oligonukleotydowe do przodu i do tyłu	Sigma-Aldrich	N/a	Podkłady są specyficzne dla eksperymentów i można je kupić u dowolnego dostępnego certyfikowanego sprzedawcy.
sprzęt
Termocykler dotykowy C1000	Bio-Rad	1851148	Może używać innego termocyklera z funkcją gradientu i studnią głębinową