Gradientowa reakcja łańcuchowa polimerazy w celu określenia optymalnej temperatury wyżarzania

Streszczenie

Źródło: Tsujimoto, H. et al., Indel Detection following CRISPR/Cas9 Mutagenesis using High-resolution Melt Analysis in the Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film demonstruje gradientową reakcję łańcuchową polimerazy w celu optymalizacji temperatury wyżarzania podkładów, która ustawia gradientową temperaturę wyżarzania wzdłuż studni. Wpływ różnych temperatur wyżarzania zależy od wydajności amplifikowanych produktów, co pomaga zoptymalizować warunki reakcji.

Protokół

1. Skanowanie w poszukiwaniu polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNP), projektowanie starterów HRMA i walidacja starterów

1. Identyfikacja SNP u komarów z kolonii laboratoryjnych typu dzikiego
   1. Wybierz docelowy ekson, aby zakłócić prawidłową translację polipeptydów.
      nuta: Cel powinien znajdować się blisko kodonu start lub wśród kluczowych reszt wymaganych do funkcjonowania białka. Im krótszy ekson (np. ≤200 zasad), tym trudniej jest go namierzyć i przeanalizować. Unikaj edycji blisko granic eksonu, ponieważ zmusza to jeden ze starterów HRMA do przejścia przez intron lub znalezienia się w intronie. Jest to niepożądane, ponieważ wskaźniki SNP są zwykle znacznie wyższe w tych regionach.
   2. Wzór podkładu
      1. Wejdź na stronę NCBI Blast - Primer Blast i wklej wybrany ekson w polu na górze strony | wybierz rozmiar produktu PCR (upewnij się, że obejmuje większość eksonu) | wybierz organizm.
      2. Kliknij Parametry zaawansowane | Wybierz (dla produktu PCR Tm) i dodaj 60 (dla optymalnej temperatury 60 °C) | Zdobądź podkłady. Pozostałe parametry należy zachować jako domyślne.
   3. Uzyskaj genomowe DNA (gDNA) z kolonii laboratoryjnej typu dzikiego. Odłóż na bok 10 komarów, znieczul je CO₂ i umieść na szalce Petriego na lodzie, aby były nieaktywne. Ustawić 10 probówek zawierających 0,5 μl odczynnika do uwalniania DNA z tkanki i 20 μl buforu do rozcieńczania, oba dostarczone w zestawie do uwalniania DNA sugerowanym w Tabeli Materiałów.
   4. Usunąć jedną nogę z pojedynczego komara za pomocą kleszczy i umieścić ją w odpowiedniej probówce z rozcieńczonym roztworem odczynnika uwalniającego DNA (od kroku 1.1.3), całkowicie zanurzając nogę w roztworze. Powtórz ten krok z pozostałymi komarami, wycierając kleszcze 70% etanolem przed przejściem do następnego.
   5. Roztwór zawierający nogę inkubować w temperaturze pokojowej przez 2-5 minut, a następnie w temperaturze 98 °C przez 2 minuty i pozostawić do ostygnięcia, przygotowując reakcję PCR.
      nuta: Płytki zawierające uwolnione gDNA mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C i w tym momencie protokół może zostać wstrzymany.
   6. Przygotować 10 probówek zawierających 10 μl 2x PCR Master Mix, startery do końcowego stężenia 0,5 μM i wodę molekularną do końcowej objętości 20 μl i przenieść 1 μl rozcieńczonej próbki do każdej probówki. Wykonać PCR zgodnie z następującymi parametrami cyklicznymi: 98 °C 5 min, 40 cykli po 98 °C przez 5 s, 60 °C 30 s, 72 °C 20 s na kb; końcowe przedłużenie temperatury 72 °C przez 1 min.
   7. Oczyść produkty PCR enzymem w celu degradacji pozostałych starterów PCR i defosforylacji nadmiaru dNTP lub dowolnego zestawu do czyszczenia kolumny. Kontynuuj sekwencjonowanie próbek.
   8. Przeanalizuj każdy elektroferogram pod kątem obecności podwójnych pików/niejednoznacznych zasad i dostosuj wywołania podstawowe ręcznie w każdej sekwencji przy użyciu odpowiedniego zdegenerowanego kodu podstawowego.
      nuta: Ten krok musi być wykonany przed wyrównaniem wielu sekwencji, ponieważ często zdarza się, że oprogramowanie wywołujące bazę wybiera bardziej widoczny pik jako "prawdziwe" wywołanie podstawowe, dając fałszywe wrażenie braku SNP.
   9. Wykonaj wyrównanie w wielu sekwencjach za pomocą oprogramowania do wyrównywania SeqMan Pro, wymienionego w tabeli materiałów lub innego oprogramowania do wyrównywania typu open source, takiego jak ClustalW lub T-Coffe.
      1. Otwórz oprogramowanie do wyrównywania | kliknij Dodaj sekwencje | wybierz żądane sekwencje i kliknij Dodaj | Po wybraniu wszystkich sekwencji kliknij Gotowe.
      2. Kliknij Zmontuj, aby wykonać wyrównanie. Aby otworzyć linię trasowania, kliknij Contig 1 i przeanalizuj wyrównanie oraz zidentyfikuj SNP (rysunek 1).
         nuta: Alternatywą dla etapów 1.1.3-1.1.6 jest to, że PCR można przeprowadzić z izolowanego genomowego DNA uzyskanego z próbek zbiorczych (pochodzących od >10 osób). Sekwencjonowane amplikony mogą być analizowane bezpośrednio pod kątem obecności SNP pojawiających się jako podwójne piki w elektroferogramie, chociaż rzadkie SNP będą trudniejsze do wykrycia.
   10. Zaprojektuj 3-5 pojedynczych przewodnikowych RNA (sgRNA), unikając regionów zawierających jakiekolwiek SNP określone powyżej, zgodnie z protokołem opisanym w.

2. Projekt podkładu HRMA

1. Przetestuj sekwencję eksonów pod kątem możliwego tworzenia się struktur drugorzędowych podczas PCR za pomocą mFold.
   1. Przejdź do serwera WWW UNAFold | kliknij na mFold | w menu rozwijanym kliknij na Aplikacje | Forma fałdowania DNA.
   2. Wprowadź nazwę sekwencji w polu i wklej ekson.
   3. Zmień temperaturę składania na 60 °C; w warunkach jonowych zmień [Mg⁺⁺] na 1,5, a w Jednostki przełącz na mM; kliknij na Złóż DNA.
   4. Na Wyjściu, poniżej Struktura 1, kliknij pdf, aby otworzyć Wykresy struktury kołowej.
2. Przejdź do NCBI Blast - Primer Blast, aby zaprojektować podkład.
3. Skopiuj i wklej wybraną sekwencję eksonów określoną przez sekwencjonowanie w kroku 1.1 (sekwencja, która zawiera najmniejszą liczbę SNP lub brak SNP) w polu u góry strony.
4. Użyj symbolu < >, aby oznaczyć i wykluczyć sekwencje zawierające SNP, miejsce docelowe i regiony, w których możliwe jest utworzenie struktury drugorzędowej.
5. Wybierz rozmiar produktu PCR w zakresie od 80 do 150 pz i wybierz organizm.
   nuta: Z powodzeniem można stosować większe rozmiary fragmentów (~300 pz). Jednak dłuższe amplikony mogą zmniejszać czułość między sekwencjami różniącymi się jedną lub tylko kilkoma parami zasad.
6. Kliknij Pobierz podkłady. Wybierz 2–3 pary starterów do przetestowania (najlepiej, aby miejsca starterów były oddalone o ≥20–50 pz od wszelkich miejsc docelowych CRISPR).

3. Walidacja podkładu

1. Wykonaj gradientowy PCR przy użyciu gDNA od jednej osoby.
   1. Przygotować mieszankę wzorcową i usunąć jedną próbkę do kontroli bez matrycy (NTC) w oddzielnej probówce. Dodać szablon do pozostałej mieszanki wzorcowej i podwielokrotność do płytki 96-dołkowej.
   2. Postępuj zgodnie z parametrami cyklu: 98 °C 30 s, 34 cykle po 98 °C przez 10 s, 55–65 °C 30 s, 72 °C 15 s; końcowe wydłużenie 72 °C przez 10 min.
   3. Generuj termiczne profile stopu według parametrów: etap denaturacji 95 °C przez 1 min, wyżarzanie 60 °C przez 1 min, wykrywanie krzywej topnienia między 75 °C a 95 °C w krokach co 0,2 °C, z czasem podtrzymania 10 s w każdej temperaturze.
      nuta: Należy stosować tylko temperatury wyżarzania z jednym termicznym profilem stopu.

Wyniki

Rysunek 1: Identyfikacja SNP. Schematyczne przedstawienie wielokrotnego wyrównania sekwencji fragmentu AaeZIP11 z typu dzikiego. Na czerwono zaznaczono SNP, a na zielono fragmenty wolne od SNP; ten region wolny od SNP jest sugerowany do projektowania sgRNA i starterów. Skróty: SNP = polimorfizm pojedynczego nukleotydu; sgRNA = pojedynczy przewodnik RNA; LVP = szczep Liverpo...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
70% etanolu			70% roztwór etanolu w wodzie
96-dołkowe płytki do PCR i PCR w czasie rzeczywistym	Firma VWR	82006-636	Do uzyskania genomowego DNA (z nogi komara)
Szablony płytek 96-dołkowych			Drukowane w domu, do rejestracji genotypu
Bio Rad CFX96	Bio Rad		Maszyna do PCR z możliwością gradientu i HRMA
Zróżnicowane rezerwuary odczynników biotechnologicznych	Firma VWR	Numer telefonu 490006-896
Zestaw do szybkiego czyszczenia Exo-PCR	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	E1050S
Szklana szalka Petriego	Firma VWR	Numer katalogowy: 89001-246	150 mm x 20 mm
Taśma uszczelniająca z akrylanu poliolefiny Nunc, Thermo Scientific	Firma VWR	Nr kat. 37000-548	Do stosowania z 96-dołkowymi płytkami PCR do uzyskiwania genomowego DNA
Zestaw do bezpośredniego PCR z tkankami zwierzęcymi Phire (bez narzędzi do pobierania próbek)	Rybak termiczny	F140WH	Do uzyskiwania genomowego DNA i wykonywania PCR
Oprogramowanie do precyzyjnej analizy stopów	Bio Rad	1845025	Służy do genotypowania próbek DNA komarów i analizy właściwości denaturacji termicznej dwuniciowego DNA (patrz krok 3.3 protokołu)
Pipetor jednokanałowy	Gilson
Zestaw do bezpośredniego PCR z tkankami zwierzęcymi Phire (bez narzędzi do pobierania próbek)	Rybak termiczny	F140WH	Do uzyskiwania genomowego DNA i wykonywania PCR
SeqMan Pro	Oprogramowanie DNAstar Lasergene		Do wyrównywania wielu sekwencji
Pipetor jednokanałowy	Gilson