Duplex Digital PCR do jednoczesnej kwantyfikacji podwójnych markerów genetycznych

Abstract

Źródło: Cao, Y., et al. Duplex Digital PCR Test do jednoczesnej kwantyfikacji Enterococcus spp. i marker HF183 związany z ludzkim kałem w wodach. J. Vis. Exp. (2016)

W tym filmie demonstrujemy technikę duplex digital PCR (ddPCR) — modyfikację tradycyjnej techniki PCR, która jest przydatna do jednoczesnego wykrywania dwóch różnych markerów genetycznych. Pojedyncza reakcja PCR jest dzielona na zemulgowane kropelki o wielkości nanolitrów, które są niezależnie amplifikowane, a wykrywanie różnokolorowych sygnałów amplifikacji fluorescencji z frakcji kropel służy do obliczenia początkowego stężenia sekwencji docelowych.

Protocol

1. Przygotowanie mieszaniny testowej

1. Przygotować podstawowe stężenia 100 μmol/L dla wszystkich starterów w wodzie molekularnej i sondach w buforze TE pH 8 [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ; HF183-1, BthetR1, BthetP].
   UWAGA: Sondy dla dwóch celów są znakowane fluorescencyjnie różnymi fluoroforami, jak wskazano na liście materiałów/sprzętu.
2. Przygotować mieszankę wzorcową, mieszając, na zaplanowaną reakcję, 12 μl cyfrowej mieszanki PCR (2x zapas, patrz Lista materiałów/sprzętu), 0,216 μl każdego startera do przodu i do tyłu, 0,06 μl każdej sondy fluorescencyjnej i 5,016 μl wody wolnej od nukleaz (końcowe stężenie: 900 nM każdy starter, 250 nM każda sonda). Pipetować w górę i w dół co najmniej 10 razy, aby wymieszać, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do roztworu.
3. Odpipetować 18 μl mieszanki wzorcowej (z kroku 1.2) do zwykłej probówki lub płytki PCR, mieszając z 6 μl matrycy DNA (ekstrahowanej w sposób opisany powyżej) w celu uzyskania mieszaniny testowej do wytwarzania kropel. W przypadku pobierania próbek w dwóch egzemplarzach należy odpipetować 36 μl mieszanki wzorcowej i 12 μl matrycy DNA do każdej studzienki. Pozostawić odpowiednie studzienki repliki puste na płytce. Uwzględnij kontrole dodatnie (patrz Wykaz materiałów/sprzętu) i nie kontroluj szablonów (NTC) (tj. z wodą molekularną użytą jako szablon).
   nuta: Kontrola pozytywna jest konieczna, aby upewnić się, że test przebiega prawidłowo, a NTC jest niezbędna, aby upewnić się, że na płytce nie ma zanieczyszczeń i ustalić fluorescencyjną linię bazową w dalszej części analizy danych. Początkującym użytkownikom zaleca się używanie zarówno nierozcieńczonych, jak i rozcieńczonych próbek DNA.

2. Generacja kropel i konfiguracja płytki PCR

1. Wymieszać mieszaniny testowe, pipetując w górę i w dół około 15 razy za pomocą pipety wielokanałowej. Upewnij się, że końcówka pipety pozostaje w cieczy, aby uniknąć tworzenia się nadmiaru pęcherzyków w mieszaninie.
2. Włóż wkład 1 (zawierający 8 dołków) do białego uchwytu na wkład i zatrzasnij uchwyt wkładu. Kartridż 1 jest teraz mocno osadzony i nie można go wysunąć z uchwytu podczas generowania kropel. Za pomocą pipety wielokanałowej delikatnie przenieść 20 μl mieszaniny testowej do środkowego położenia wkładu oznaczonego "Próbka", nie wprowadzając pęcherzyków powietrza.
3. Odpipetować 70 μl oleju wytwarzającego kropelki po lewej stronie wkładu (oznaczonego "Olej").
4. Przykryj wkład uszczelką, upewniając się, że uszczelka jest płaska i równomiernie trzymana przez 4 znaczniki w kierunku krawędzi wkładu. Naciśnij podświetlony na zielono przycisk na generatorze kropel, aby otworzyć i umieścić wkład. Naciśnij ponownie przycisk z zielonym światłem, aby zamknąć generator.
   nuta: Po zamknięciu drzwi przycisk jest przyciemniony, drzwi nie mogą być ponownie otwarte i natychmiast rozpoczyna się wytwarzanie kropel, które trwa przez około 1 minutę.
5. Jeśli wykonujesz więcej niż 8 reakcji, umieść wkład 2 w drugim białym uchwycie na wkład i przygotuj go w taki sam sposób, jak wkład 1, podczas gdy trwa wytwarzanie kropli, aby zaoszczędzić całkowity czas konfiguracji.
6. Otwórz drzwiczki generatora kropel, gdy przyciemniony przycisk zmieni kolor na zielony, wskazując zakończenie generowania kropel. Wyjmij biały uchwyt wkładu zawierającego wkład 1, odłóż go na bok i umieść wkład 2 na generatorze kropel.
7. Usuń uszczelkę z wkładu 1 i wyrzuć. Delikatnie przenieść całkowitą objętość (około 40 μl) wytworzonych kropel z trzeciej kolumny wkładu (oznaczonej "Kropelkami") na końcową płytkę PCR (utrzymywaną w temperaturze pokojowej) w celu przeprowadzenia cykli termicznych.
   nuta: Nie odłączaj białego uchwytu na wkład, ponieważ może to spowodować przerwanie nowo wygenerowanych kropel; Uchwyt wkładu należy otwierać dopiero po przeniesieniu kropelek na ostateczną płytkę.
8. Powtórzyć kroki 2.1-2.7 dla dodatkowych próbek.
9. Gdy wszystkie kropelki znajdą się na końcowej płytce do PCR, umieść na niej foliową osłonę z możliwością przekłuwania i umieść ją na uszczelniarce do płytek. Ustaw zgrzewarkę na 180 °C, naciśnij przycisk "Play" na zgrzewarce i pozostaw na 10 sekund.

3. Cykl termiczny i odczyt kropelek

1. Umieść zapieczętowaną płytkę na termocyklerze, kompatybilną z końcową płytką PCR użytą w kroku 2.7 i prędkość narastania temperatury 2.0 °C/s.
2. Uruchomić program termiczny w następujący sposób: 10 minut w temperaturze 95 °C, następnie 40 cykli po 30 sekund w temperaturze 94 °C i 60 sekund w temperaturze 60 °C, a następnie 10-minutowe zatrzymanie w temperaturze 98 °C (opcjonalnie: końcowe zatrzymanie w temperaturze 4 lub 15 °C).
3. Po zakończeniu cyklu przenieś płytkę do czytnika kropel w celu automatycznego pomiaru fluorescencji w każdej kropli w każdym dołku. Alternatywnie, należy przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C do 3 dni przed odczytem kropli. Upewnij się, że kropelki mają temperaturę pokojową przed przystąpieniem do czytania.
   1. Otwórz dołączone oprogramowanie, aby skonfigurować odczyt kropel. W domyślnym menu "Ustawienia" zawierającym schemat pustej płytki 96-dołkowej, kliknij dwukrotnie na basenik A1, aby otworzyć menu zawierające trzy sekcje: "Próbka", "Test 1" i "Test 2".
   2. W sekcji "Próbka" wpisz identyfikator próbki w polu oznaczonym "Nazwa" i naciśnij enter lub zaznacz pole po prawej stronie oznaczone jako "Zastosuj". Następnie kliknij menu rozwijane oznaczone "Eksperyment" i wybierz "CZERWONY" (wykrywanie rzadkich zdarzeń) i kliknij enter.
   3. Przejdź do sekcji oznaczonej jako "Test 1". W sekcji "Nazwa" wpisz test (np. Enterococcus) i kliknij Enter. W polu poniżej oznaczonym "Typ" kliknij menu rozwijane, wybierz "Kanał 1 nieznany" i kliknij Enter.
   4. Przejdź do sekcji oznaczonej jako "Test 2". W sekcji "Nazwa" wypełnij test (np. HF183) i kliknij Enter. W polu poniżej oznaczonym "Typ" kliknij menu rozwijane, wybierz "Kanał 2 nieznany" i kliknij Enter. Wszystkie informacje z kroków 3.3.2 do 3.3.4 są teraz obecne w studzience A1.
   5. Nazwij wszystkie kolejne studzienki zawierające kropelki. Aby zaoszczędzić całkowity czas instalacji, kliknij "Shift" lub "Ctrl", aby wybrać wiele dołków jednocześnie.
   6. Gdy cyfrowy obraz tablicy odzwierciedla fizyczną tablicę, naciśnij przycisk "OK" w prawym dolnym rogu menu. W nowym menu, które pojawi się w górnej części schematu płyty, w sekcji "Szablon" wybierz "Zapisz jako" oraz nazwij i zapisz płytę.
   7. Po lewej stronie ekranu kliknij "Uruchom" i wybierz odpowiedni zestaw barwników w wyskakującym oknie "Opcje uruchamiania". Rozpoczyna się zbieranie danych, które są wyświetlane w czasie rzeczywistym w oprogramowaniu.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mikroprobówki o niskim poziomie wiązania	Costar	3207	Do przechowywania odczynników, próbek/produkcji mieszanek wzorcowych
Woda wolna od nukleaz	Rybak Sci	Zobacz materiał BP2484-50
Bufor TE pH 8	Rybak Sci	Zobacz materiał BP2473-100
Płytka 96-dołkowa Hardshell	Przedsiębiorstwo BioRad	Zobacz materiał HSP-9601	Do wstępnej mieszanki wzorcowej i inokulacji próbki
Aluminiowa folia uszczelniająca	Przedsiębiorstwo BioRad	359-0133	Aby uszczelnić płytkę próbki
Generator kropel	Przedsiębiorstwo BioRad	186-3002
Olej generujący kropelki	Przedsiębiorstwo BioRad	186-3005
nabój	Przedsiębiorstwo BioRad	186-4008
Uchwyt na wkład DG8	Przedsiębiorstwo BioRad	186-3051
uszczelka	Przedsiębiorstwo BioRad	Numer katalogowy: 186-3009
Końcówki do pipet 20 μl	Rainin	GP-L10F	Do tansferringu próbki/mieszanki wzorcowej do kartridżu
Końcówki do pipet 200 μl	Rainin	GP-L200F	Do przenoszenia kropel na końcową płytkę Twin.Tec
Płytka 96-dołkowa Twin.Tec	Eppendorf	951020320	Do końcowych kropel, cykli termicznych i odczytu
Przebijalna folia termozgrzewalna	Przedsiębiorstwo BioRad	Numer katalogowy: 181-4040	Do uszczelniania płyty Twin.Tec przed cyklami termicznymi
Zgrzewarka do płytek PCR PX1	Przedsiębiorstwo BioRad	Numer katalogowy: 181-4000	Potrzebny jest tylko termocykler, bez optyki
CFX96 Termocykler	Przedsiębiorstwo BioRad	CFX96 oraz C1000
Czytnik kropel QX100	Przedsiębiorstwo BioRad	Numer katalogowy: 186-3001
Czytnik kropelek Olej	Przedsiębiorstwo BioRad	186-3004
Kropelkowy PCR Supermix	Przedsiębiorstwo BioRad	Nr kat. 186-3024	tj. cyfrowa mieszanka PCR w rękopisie
Oprogramowanie QuantaSoft (wersja 1.3.2)	Oprogramowanie Quantasoft	Certyfikat QX100	Do przeglądania, analizowania i eksportowania danych ddPCR
Entero Forward Primer (ent F1A)	Operon	GAGAAATTCCAAACGAACTTG powiedział:	Można użyć alternatywnego dostawcy
Entero Reverse Primer (ent R1)	Operon	CAGTGCTCTACCTCCATCATT powiedział:	Można użyć alternatywnego dostawcy
Sonda Entero (GPL813TQ)	Operon	[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]	Można użyć alternatywnego dostawcy, ale fluorofor musi być FAM
HF183 Podkład do przodu (HF183-1)	Operon	ATCATGAGTTCACATGTCCG powiedział:	Można użyć alternatywnego dostawcy
HF183 Podkład odwrotny (BthetR1)	Operon	CGTAGGAGTTTGGACCGTGT	Można użyć alternatywnego dostawcy
Sonda HF183 (BthetP1)	Operon	[6-SZESNASTK]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]	Można użyć alternatywnego dostawcy, ale fluorofor musi być HEX (jeśli używasz VIC, należy wybrać odpowiednią kompensację matrycową).
Kontrola pozytywna			Mieszanina genomowego DNA E.faecalis i standardowego plazmidu HF183 (zamówiona w IDT). Szczegółowe metody hodowli E. faecalis i sekwencji uporządkowanego plazmidu HF183 można znaleźć w Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Dostępne na rynku wzorce DNA Enterococcus (ATCC 29212Q-FZ) mogą być również stosowane w kontroli pozytywnej zamiast genomowego DNA E. faecalis przygotowanego w laboratorium.