1. Kwantyfikacja RNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego
- Upewnij się, że ustawienia spektrofotometru są ustawione na RNA.
- Użyj 1-2 μl wody molekularnej, aby zainicjować maszynę i ustawić linię bazową.
- Użyj 1-2 μl każdej badanej próbki RNA, aby ocenić ilość RNA.
- Zapisz odczyty i dokumentuj.
- W razie potrzeby dostosować RNA do 1 μg/μl.
nuta: RNA musi być przez cały czas przechowywane na lodzie (lub w chłodnym bloku). Jeśli RNA jest otrzymywany przy użyciu metody kolumnowej lub perełkowej, RNA jest zwykle mniejszy niż 1 μg/μL. W takiej sytuacji użyj RNA schludnie.
2. Przygotowanie serii rozcieńczeń RNA w celu określenia czułości punktu końcowego
- Wykonaj 10-krotne seryjne rozcieńczenie RNA.
- Oznaczyć probówki serią rozcieńczeń (np. 10-1, 10-2 itd.) i szczegółami RNA.
- Do każdej probówki dodać 45 μl wody molekularnej.
- Dodać 5 μl RNA (uprzednio rozcieńczonego do 1 μg/μl) i dobrze wymieszać.
- Wyrzuć końcówkę pipety do odpowiedniego środka dezynfekującego i zastąp ją świeżą końcówką.
- Weź 5 μl z 10-1 probówki i dodaj do 10-2 probówki i dobrze wymieszaj.
- Powtórzyć czynności 2.1.3-2.1.5 z pozostałymi rozcieńczeniami.
UWAGA: RNA musi być przez cały czas przechowywane na lodzie (lub w chłodnym bloku).
3. Przygotowanie reakcji RT-PCR w czasie rzeczywistym
- Korzystając z arkusza kalkulacyjnego, zaplanuj układ płytek zgodnie z liczbą próbek testowych i próbek kontrolnych, zarówno dla testów na wirusa lyssa, jak i ß-aktyny.
nuta: Jeśli 4 próbki mają być badane podwójnie z kontrolą dodatnią i ujemną, odpowiada to 10 reakcjom dla obu testów.
- W "pomieszczeniu czystym" lub obszarze oddzielonym od matrycy RNA przed użyciem przetrzyj powierzchnie odpowiednim środkiem dezynfekującym lub przygotuj stację roboczą do PCR (jeśli używasz). Aby przygotować stanowisko pracy, przetrzyj powierzchnię szafki odpowiednim środkiem dezynfekującym i umieść potrzebne przedmioty na stanowisku pracy i zamknij drzwi. Włącz światło UV na 10 minut.
- Wyjmij regenty i startery z zamrażarki i rozmroź (odczynniki wymienione w tabeli 1 i startery w tabeli 2).
UWAGA: Mieszanina enzymów jest przechowywana w glicerolu, więc nie wymaga rozmrażania i musi być przez cały czas przechowywana na lodzie (lub w chłodnym bloku). Wszystkie inne odczynniki można rozmrażać w temperaturze pokojowej.
- Po rozmrożeniu wymieszaj odczynniki i krótko odwiruj, aby zebrać płyn.
UWAGA: Nie mieszaj mieszaniny enzymów, tylko krótko odwiruj.
- Przygotować oddzielne mieszanki wzorcowe dla lizsywirusa i ß-aktyny. Do każdej reakcji dodać 7,55 μl wody molekularnej, 10 μl 2x uniwersalnej zielonej mieszanki reakcyjnej SYBR, 0,6 μl startera do przodu, 0,6 μl startera odwrotnego, 0,25 μl mieszanki enzymatycznej iTaq RT.
- Użyj arkusza kalkulacyjnego do obliczenia prawidłowych objętości, aby uniknąć błędów w ręcznym obliczaniu. Upewnij się, że przygotowana jest wystarczająca ilość mieszanki wzorcowej, aby skompensować błędy pipetowania. Dlatego, jeżeli wymaganych jest 10 reakcji (patrz UWAGA w ppkt 3.1), należy przygotować 12 reakcji
- Przygotuj mieszankę wzorcową na lodzie (lub w chłodnym bloku) i pozostań na lodzie do momentu umieszczenia w maszynie czasu rzeczywistego.
- Wymieszać przygotowane mieszanki wzorcowe, krótko odwirować i dozować 19 μl do odpowiednich dołków w probówkach paskowych lub na 96-dołkowej płytce kompatybilnej z używaną maszyną czasu rzeczywistego.
UWAGA: Podczas pipetowania należy zminimalizować wytwarzanie pęcherzyków w studzienkach.
- W oddzielnym pomieszczeniu lub w komorze UV przygotowanej zgodnie z opisem w ppkt 3.2, ostrożnie dodać 1 μl RNA uprzednio dostosowanego do 1 μg/μl (patrz krok 1.5) poniżej powierzchni odpowiedniej studzienki wzorcowej i delikatnie wymieszać. Wyrzuć końcówkę pipety do środka dezynfekującego bezpośrednio po użyciu (pod powierzchnią).
- Dodać kontrole po próbkach testowych, z kontrolą pozytywną dodaną jako następną i kontrolą bez matrycy (NTC – woda o jakości cząsteczkowej) dodaną na końcu. Ilość użytego RNA może być zmieniona w zależności od rodzaju próbki i zastosowanej ekstrakcji RNA. Użyta ilość musi zostać zweryfikowana, aby zapewnić optymalizację reakcji.
- Uszczelnić płytkę za pomocą wieczek paskowych lub zgrzewarki, zwracając uwagę, aby upewnić się, że wszystkie pokrywki są szczelnie zamknięte i wystarczająco oznaczone, aby można było zorientować próbki. Oznacz krawędź rurki z płytą/paskiem.
- Odwiruj próbki za pomocą wirówki, aby zebrać całą ciecz na dnie studzienek.
- Przenieś płytkę do maszyny do PCR w czasie rzeczywistym, otwórz drzwiczki i umieść ją w uchwycie, zapewniając prawidłowe położenie/orientację próbek zgodnie z układem płytki.
UWAGA: Jeśli używane są paski rurowe, upewnij się, że uchwyt jest na swoim miejscu.
- Otwórz program maszyny do PCR w czasie rzeczywistym i wybierz opcję eksperymentu SYBR w czasie rzeczywistym z krzywą dysocjacji. Zaprogramować maszynę do PCR w czasie rzeczywistym, korzystając z warunków cykli termicznych określonych w tabeli 3, w tym punktów gromadzenia danych.
- Wybierz SYBR jako barwnik fluorescencyjny i wybierz nieznany jako typ próbki i wstaw nazwę w odpowiednim polu nazwy próbki.
nuta: Rozróżnij między powtórzeniami, a także między studzienkami lyssawirusa i ß-aktyny.
- Wybierz lokalizację pliku, aby zapisać dane eksperymentalne, upewnij się, że lampa zostanie wyłączona po zakończeniu przebiegu, a następnie rozpocznij uruchamianie.
UWAGA: Ponieważ pierwszym krokiem jest RT stage, w tym czasie nie są zbierane żadne dane, dlatego jeśli lampa wymaga okresu nagrzewania, może to nastąpić podczas RT stage. Maszyna i oprogramowanie działające w czasie rzeczywistym będą wyświetlać krzywe wzmocnienia w czasie rzeczywistym, podczas gdy krzywa topnienia zostanie wygenerowana pod koniec cyklu.
