Blokowanie PCR typu dzikiego w celu wykrycia mutacji somatycznych o niskiej częstotliwości

Streszczenie

Źródło: Albitar, A. Z. et al., Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film opisuje reakcję łańcuchową polimerazy blokującej typu dzikiego, czyli WTB-PCR, która wykrywa mutacje somatyczne. Technika oparta na PCR wykorzystuje zablokowany kwas nukleinowy lub LNA, oligonukleotyd, który wiąże się ze swoim komplementarnym allelem typu dzikiego i blokuje jego wydłużenie. Blokowanie selektywnie umożliwia amplifikację zmutowanych alleli niskiego poziomu w stosunku do ich wariantów typu dzikiego w próbce.

Protokół

1. Ekstrakcja DNA z tkanki FFPE, krwi obwodowej i aspiratu szpiku kostnego

1. Do tkanki FFPE szpiku kostnego z zestawem do ekstrakcji DNA FFPE
   1. Zacznij od tkanki FFPE z niebarwionych szkiełek (5 - 10 odcinków o grubości 5 - 10 μm).
      nuta: Jeśli zaczynasz od wiórów tkankowych, użyj 3 - 6 odcinków o grubości 5 - 10 μm i przejdź do kroku 1.1.6.
   2. Umieść szkiełka w koszu na szkiełka i przygotuj cztery zbiorniki do mycia (dwa na ksylen i dwa na 100% alkohol). Dodać minimalną objętość 600 ml roztworu do każdego koszyka.
   3. Odparafinować szkiełka, wykonując 5-minutowe mycie ksylenem w pierwszej tacy. Przenieś szkiełka do drugiego zbiornika do mycia ksylenem na dodatkowe 5 minut.
   4. Po odparafinowaniu myć szkiełka 100% alkoholem przez 5 min. Przenieść szkiełka do drugiego zbiornika do mycia alkoholem na dodatkowe 5 minut.
   5. Pozostaw szkiełka do całkowitego wyschnięcia pod maską, a następnie zeskrob je żyletką do probówki do mikrowirówki.
      nuta: Jeśli dostępny jest szkiełko H&E ze wskazanym regionem guza, wyrównaj szkiełka i zeskrob tylko obszar guza.
   6. Postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w ulotce producenta dołączonej do zestawu.
2. Do aspiratu BM i krwi obwodowej
   1. Wyodrębnij zgodnie z instrukcjami producenta, ulotką z tymi specyfikacjami.
      nuta: Istnieje wiele dostępnych na rynku zestawów i metod ekstrakcji DNA z tkanek i komórek FFPE. Praktycznie wszystkie mogą być używane. Użyj metody, która została ustalona w laboratorium.
      1. Użyj 200 μl krwi obwodowej (PB) lub 100 μl BM + 100 μL PBS.
      2. Użyj 4 μl RNazy A roztworu podstawowego.
      3. Eluować za pomocą 100 μl buforu elucyjnego.
3. Kwantyfikacja DNA
   1. Zmierz stężenie DNA za pomocą spektrofotometru, zapewniając stosunek 260 nm do 280 nm wynoszący około 1,8 (dla czystego DNA). Jeśli stosunek ten jest znacznie niższy, może to wskazywać na obecność białka, fenolu lub innych zanieczyszczeń, które mogą zakłócać dalsze zastosowania.
   2. Dostosuj stężenia DNA do około 50 - 100 ng/μl za pomocą odpowiedniego buforu elucyjnego.

2. PCR blokujący typu dzikiego

1. Projekt podkładu
   1. Zaprojektuj i uzyskaj startery dla interesujących genów zgodnie z wcześniej opisanymi ogólnymi wytycznymi projektowania starterów PCR. Dołącz uniwersalne startery sekwencjonowania M13 do przodu i do tyłu we starterach PCR.
      nuta: Test MYD88 został opracowany w celu amplifikacji eksonu 5 MYD88 (G259 - N291) i 110 nukleotydów znajdujących się w regionie intronowym 5' w celu pokrycia miejsca splicingu i części intronu 4. Startery do przodu i do tyłu zostały zaprojektowane z sekwencją 5'-M13 (M13- naprzód: tgt aaa acg acg gcc agt; M13-reverse: cag gaa aca gct atg acc), aby umożliwić wyżarzanie komplementarnych starterów sekwencjonujących (patrz tabela materiałów).
2. Konstrukcja z zablokowanym oligonukleotydem kwasu nukleinowego
   1. Zaprojektuj oligonukleotyd blokujący tak, aby miał około 10 - 15 zasad długości i był komplementarny z matrycą WT, w której pożądane jest wzbogacenie mutantów.
      nuta: Krótszy oligo poprawi dyskryminację w niedopasowaniu. Aby osiągnąć wysoką swoistość docelową, ważne jest, aby nie używać zbyt wielu nukleotydów blokujących, ponieważ może to spowodować bardzo "lepki" oligonukleotyd. Zawartość i długość oraz nukleotyd blokujący powinny być zoptymalizowane w zależności od konkretnego nukleotydu, który należy zablokować. Ważne jest, aby osiągnąć wysoką specyficzność wiązania bez naruszania struktury drugorzędowej i ryzyka samokomplementarności.
   2. Zaprojektuj oligo blokującego tak, aby jego temperatura wynosiła 10–15 °C powyżej temperatury rozciągania podczas termocyklingu. Dostosuj_TM, dodając lub usuwając zasady blokujące lub zastępując zasady blokujące DNA, unikając długich odcinków (3 - 4 zasady) blokowania zasad G lub C.
      1. Przejdź do strony internetowej Oligo Tools (patrz Spis Materiałów) i wybierz narzędzie "blocking Oligo T_m Prediction".
      2. Wklej sekwencję szablonu WT, która ma zostać zablokowana, w polu "Sekwencja oligo". Dodaj znak "+" przed podstawami, aby wskazać podstawy blokujące.
      3. Wybierz przycisk "Oblicz", aby określić przybliżoną T_m hybrydy DNA-Blocker.
   3. Zaprojektuj oligo blokującego, aby uniknąć tworzenia się struktur drugorzędowych lub samo-dimerów.
      1. Przejdź do strony Oligo tools (patrz Spis materiałów) i wybierz narzędzie "blokowanie Oligo Optimizer".
      2. Wklej sekwencję szablonu WT, która ma zostać zablokowana, do pola. Dodaj znak "+" przed podstawami, aby wskazać podstawy blokujące.
      3. Zaznacz dwa pola "Struktura drugorzędna" i "Tylko własna". Naciśnij przycisk Analizuj, aby przejrzeć oligo pod kątem potencjalnie kłopotliwych struktur drugorzędowych lub samo-dimerów.
         nuta: Wyniki reprezentują bardzo przybliżone szacunki_{TM struktur} drugorzędowych i samo-dimerów. Niższe wyniki są zatem optymalne i można je osiągnąć, ograniczając parowanie bloker-bloker. Oligonukleotyd blokujący dla MYD88 [bloker MYD88 (TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/)] został zaprojektowany tak, aby pokryć aminokwasy Q262-I266 i zawiera odwrócony przez 3' dT, który hamuje zarówno wydłużanie przez polimerazę DNA, jak i degradację przez 3'-egzonukleazę. Ten specyficzny oligo blokujący to 17 mer z 10 zasadami blokującymi, które są oznaczone jako "+N". Pozostałe 7 zasad to zwykłe nukleotydy DNA.
3. Konfiguracja WTB-PCR i termocykl
   1. Przygotuj główną mieszaninę WTB-PCR (MMX) przy użyciu 2,5 μl buforu reakcyjnego PCR 10x z 20 mM MgCl₂, 250 μM dNTP, 0,2 μM startera do przodu i do tyłu, 1,2 μM blokera MYD88 i DNAzy, wolnego od RNAse, ultraczystego_H2O, aby uzyskać końcową objętość roztworu 21,75 μl na reakcję.
      nuta: Stężenia robocze dotyczą końcowej objętości reakcyjnej wynoszącej 25 μl (po dodaniu matrycy DNA i polimerazy). Konwencjonalny PCR MMX przygotowuje się po prostu pomijając dodanie blokera. Wszystkie kroki protokołu pozostają identyczne zarówno dla WTB, jak i konwencjonalnego PCR. Można to wykorzystać do walidacji i określenia wzbogacenia osiągniętego przez dodanie blokera.
      1. Obliczając ilość MMX do przygotowania, należy wziąć pod uwagę 3 dodatkowe reakcje (kontrole dodatnie i ujemne oraz kontrolę bez matrycy w celu sprawdzenia zanieczyszczenia) i co najmniej 1 dodatkową reakcję w przypadku błędu pipetowania.
   2. Dokładnie przekręć MMX. MMX może być przechowywany w temperaturze -80 °C przez okres do roku.
   3. Dodać 0,25 μl polimerazy DNA Taq na reakcję do MMX i odwrócić do mieszania. Po dodaniu polimerazy do MMX trzymaj ją na lodzie.
   4. Umieść nową 96-dołkową płytkę do PCR na zimnej płytce i odpipetuj 22 μl MMX z polimerazą do każdej studzienki reakcyjnej.
   5. Dodać 3 μl genomowego DNA (50 - 100 ng/μl do każdej z studzienek zawierających MMX z polimerazą.
   6. Uszczelnij płytkę i odwiruj na krótko, aby upewnić się, że roztwór dotrze do dna każdej studzienki.
   7. Załaduj płytkę PCR do termocyklera.
      1. Ustawić warunki termocyklingu dla reakcji WTB-PCR w następujący sposób: początkowa denaturacja w temperaturze 95 °C przez 6 minut; 40 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 30 s, wyżarzanie startera w temperaturze 56 °C przez 30 s i przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 1 min 20 s; końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 min.
         nuta: Najlepsza praktyka polega na wypełnieniu pozostałej części protokołu w fizycznie oddzielonym obszarze, aby uniknąć zanieczyszczenia amplikonem w przyszłych konfiguracjach.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówki wirówkowe Safe-Lock o pojemności 1,5 lub 2 ml	Eppendorf	Numer katalogowy: 05-402-25
100% alkoholu	Firma VWR	Numer katalogowy: 89370-084	Ocena histologiczna; 91,5% etanol, 5% alkohol izopropylowy, 4,5% alkohol metylowy
Aluminiowe folie uszczelniające	GeneMate (Komórka GeneMate)	T-2451-1	Do PCR i przechowywania w chłodni
Wirówka serii 5804	Eppendorf		Rotor A-2-DWP (na płytkę PCR)
Zimna płyta do płytek 96-dołkowych	Eppendorf	Z606634
DNAzy, woda wolna od RNAzy, ultraczysta
dNTP (100 mM)	Invitrogen	Numer katalogowy: 10297-117
Absolutny poziom etanolu	Sigma	E7023	200 proof, dla biologii molekularnej
Witryna internetowa Exiqon Oligo Tools			http://www.exiqon.com/oligo-tools
Polimeraza DNA FastStart Taq (5 U/μL)	Roche	12032937001	Z 10x skoncentrowanym buforem reakcyjnym PCR, z 20 mM MgCl2
Aparatura do elektroforezy żelowej			2% żel agarozowy
Oligonukleotyd LNA	Eksikon Exiqon	Numer katalogowy: 500100	5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A +T+CC/invdT/ (+N = zasady LNA)
Mastercycler Pro S Termocykler	Eppendorf	E950030020
Wirówka mikrowirówkowa model 5430	Eppendorf		Rotor FA-45-30-11 (do probówek do mikrowirówek 1,5/2 ml)
Spektrofotometr NanoDrop 2000	Thermo Fisher Naukowy
Starter do przodu PCR	Identyfikator IDT		5'-TGT AAA, ACG, ACG, GCC, AGT, AGT, TGC, CAG, GGG, TAC, TTA, GAT, GG
Odwrócony starter do PCR	Identyfikator IDT		5'-cag gaa aca gct atg acc ggt tgg tgg tgt agt cgc aga ca
Płytki do PCR	GeneMate (Komórka GeneMate)	T-3107-1
Pipety			20, 200, 1 000 μL
Mini zestaw QIAamp DNA	Qiagen powiedział:	Numer katalogowy: 51304	Do aspiratu BM i krwi obwodowej
Dżin wirowy	Branże naukowe	SI-0236
Kosz przesuwny