$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotuj reakcje qPCR
UWAGA: Jedna reakcja PCR dotyczy jednej próbki. Każda reakcja PCR zawiera 5 μl głównej mieszaniny qPCR (patrz materiały), 1 μl mieszaniny 5 μM par starterów, 2 μLH2Oi 2 μl próbki faga T7 poddanej obróbce cieplnej. W przypadku wielokrotnych reakcji PCR wszystkie odczynniki z wyjątkiem próbki faga są wstępnie mieszane w jednej probówce o pojemności 1,5 ml. Objętość każdego odczynnika w premiksie zależy od liczby próbek fagów do qPCR.
- Przygotować premiks qPCR dla 10 biopanowanych próbek fagów o nieznanym stężeniu i 7 próbek o standardowych stężeniach w trzech egzemplarzach. W rezultacie mamy do czynienia z 51 próbkami ogółem, a zatem 51 reakcji qPCR (tj. jedna reakcja na próbkę). Dla 51 reakcji należy przygotować premiks składający się z 255 μl głównej mieszanki qPCR (51x 5 μL), 51 μl starterów (51x 1 μL) i 102 μLH2O(51x 2 μL).
nuta: Zaleca się przygotowanie kilku dodatkowych reakcji PCR w celu skompensowania utraty objętości podczas porcjowania mieszaniny PCR do każdego dołka 96-dołkowej płytki qPCR.
- Podaniec 8 μl premiksu PCR do każdego dołka 96-dołkowej płytki qPCR, co daje w sumie 51 dołków (tj. 51 reakcji qPCR). Nie ma potrzeby wymiany końcówek podczas porcjowania.
- Dodać 2 μl poddanych obróbce cieplnej próbek fagów T7 lub referencyjnego DNA faga T7 do każdej studzienki (ryc. 1B); zmieniaj końcówki podczas dodawania różnych próbek DNA do studzienki, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu. Należy również dozować 2 μl próbek DNA pod powierzchnią premiksu qPCR (tj. do premiksu 8 μl PCR).
- Uszczelnij płytkę qPCR folią samoprzylepną.
nuta: Ten krok ma kluczowe znaczenie, niezależnie od rodzaju płytki qPCR. Użyj zalecanego zestawu, aby całkowicie uszczelnić płytę; w przeciwnym razie każdy nieuszczelniony obszar na płytce spowoduje utratę objętości podczas cykli PCR.
- Owiń płytkę qPCR folią aluminiową, aby zminimalizować fotowybielanie fluorescencyjne i przystąp do uruchamiania jej na sprzęcie qPCR.
2. warunki cykliczne qPCR
UWAGA: warunki cykliczne qPCR zostały ustawione na konkretnym sprzęcie qPCR.
- Uruchomić 96-dołkową płytkę qPCR na sprzęcie qPCR. Na urządzeniu wybierz ustawienia z menu, aby skonfigurować następujące warunki eksperymentalne (Rysunek 1C).
- Dla objętości próbki 10 μl należy ustawić następujące warunki cykliczne: jeden cykl w temperaturze 50°C przez 2 minuty, jeden cykl w temperaturze 95°C przez 2 minuty, a następnie 40 cykli (95°C przez 15 s, 60°C przez 1 min). Następnie uruchom ustawienia krzywej topnienia: jeden cykl 95°C przez 15 s, 60°C przez 1 min i 95°C 15 s.
- Przejdź do analizy danych.
