$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Asymetryczny PCR do amplifikacji ssDNA
- Przygotuj asymetryczną mieszaninę odczynników PCR do amplifikacji ssDNA do analizy. Rozmrozić odczynniki z tabeli 1 na lodzie. Nie należy przechowywać enzymu polimerazy Taq (50 U/μl) na lodzie, ale przechowywać go w temperaturze 20 °C do czasu, gdy będzie potrzebny.
- Delikatnie wymieszaj wszystkie odczynniki, a następnie krótko odwiruj probówki o sile 10 000 x g przez 10 sekund.
- Połączyć wszystkie odczynniki zgodnie z opisem w tabeli 1.
- Umieścić próbki w termocyklerze i rozpocząć asymetryczny PCR w następujących warunkach: 25 cykli (95 °C przez 30 s, 52 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s), 85 °C przez 5 minut, trzymać w temperaturze 4 °C.
2. Microsphere-PCR do amplifikacji ssDNA
UWAGA: Ta sekcja opisuje protokół amplifikacji ssDNA w probówce reakcyjnej PCR. Reakcje Microsphere-PCR przeprowadzono w 50 μL objętości reakcji. Szczegółowe sekwencje stosowane do amplifikacji ssDNA są wymienione w Tabeli 2. W tym przypadku Ap na powierzchni mikrosfer może wyżarzać się do losowych matryc DNA w sposób komplementarny. Jest to bardzo ważny krok w wytwarzaniu komplementarnych nici DNA (antysensowna nić DNA, ryc. 1). Wydłużone DNA jest używane jako matryca do amplifikacji mikrosferycznej PCR.
- Przygotuj mieszaninę odczynników do mikrosfery i PCR. Rozmrozić odczynniki z tabeli 3 na lodzie; jednak nie należy przechowywać enzymu polimerazy Taq na lodzie. Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie potrzebny.
- Delikatnie wymieszaj wszystkie odczynniki, a następnie krótko odwiruj probówki o sile 10 000 x g przez 10 sekund.
- Uzyskaj około ~25 mikrosfer poprzez mikroskopijne liczenie.
nuta: Liczbę mikrosfer w jednej probówce reakcyjnej oblicza się za pomocą mikroskopu świetlnego o 40-krotnym powiększeniu. Około ~25 mikrosfer jest używanych do amplifikacji mikrosferycznej PCR. Bardziej szczegółowe informacje znajdują się w kroku 3.
- Połączyć wszystkie odczynniki zgodnie z opisem w Tabeli 3.
- Umieścić próbki w termocyklerze i rozpocząć asymetryczny PCR w następujących warunkach: 25 cykli (95 °C przez 30 s, 52 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s), 85 °C przez 5 minut, trzymać w temperaturze 4 °C.
- Po amplifikacji dodać 8 μl 6-krotnego buforu ładującego i załadować 15 μl każdej próbki do 2% żelu agarozowego. Następnie wykonaj elektroforezę pod napięciem 100 V przez 35 minut w buforze 1x TAE (Tris-acetate-EDTA, 40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA, pH 8,2).
Tabela 1. Asymetryczne składniki odczynnika PCR mieszają się w 20 μl reakcji.
pkt.
pkt.
Rozdział
| Odczynnik | Objętość na 1x reakcja (μL) | Końcowe stężenie |
| Losowa matryca DNA | 1 | 1 ng/μl |
| Podkład do tag-forward | 1 | 0,4 μM |
| Odwrócony podkład | 1 | 0,02 μM |
| 10X bufor Taq | 5 | 1X |
| 10 mM dNTP | 4 | 2,5 mM |
| Ex taq (1000U) | 0,2 | 1 U |
| Woda | 37,8 | - |
| łączny | 50 | - |
Tabela 2. Informacje o sekwencji dla Microsphere-PCR.
| szablon | kolejność | Długość (nt) |
| Losowa matryca DNA | 5'- ATA CCA GCT TAT TCA ATT (sekwencja losowa, 40 mer) AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3' | 76 Rozdział 76 |
| Podkład Tag-Forward (Tag-F) | 5'- GGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3' | 42 Rozdział 42 |
| Odwrócony podkład | 5'- AGA TTG CAC TTA CTA TCT-3' | Rozdział 18 |
Tabela 3. Składniki odczynnika Microsphere-PCR mieszają się w reakcji 50 μl
pkt.
pkt.
Rozdział
| Odczynnik | Objętość na 1x reakcja (μL) | Końcowe stężenie |
| Mikrosfery Ap | ~25 mikrosfer | - |
| Losowa matryca DNA | 1 | 1 ng/μl |
| Podkład Tag-Forward | 1 | 0,4 μM |
| 10X bufor Taq | 5 | 1X |
| 10 mM dNTP | 4 | 2,5 mM |
| Ex taq (1000U) | 0,2 | 1 U |
| Woda | 37,8 | - |
| łączny | 50 | - |
