$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Odwrotna transkrypcja wirusowego RNA
- Wyjmij odczynniki RT wymienione w Tabeli 1 z zamrażarki, trzymaj je na lodzie, a następnie rozmrozić i zwirować przed użyciem.
- Przygotować 12 μl mieszaniny reakcyjnej RT w probówce PCR o pojemności 0,2 ml z odczynnikami wymienionymi w tabeli 1. Pozwolić na zmiany w pipetowaniu, przygotowując objętość mieszaniny wzorcowej o co najmniej jedną wielkość reakcji większą niż jest to wymagane.
- Dodać 8 μl próbki, RNA kontroli dodatniej lub kontroli ujemnej do mieszaniny reakcji RT na stacji roboczej PCR w pomieszczeniu z szablonami. Kontrola pozytywna RT to RNA wyekstrahowane z hodowli komórkowej zakażonej utrwalonym szczepem RABV CVS-11 (prowokacyjny wirus standard-11) i przechowywany w temperaturze -80°C. Kontrola ujemna zawiera DDh2O wolne od RNaz.
- Wymieszać zawartość probówek RT przez wierzchołkowanie, a następnie krótko odwirować.
- Załaduj probówki reakcyjne do termocyklera. Skonfiguruj program syntezy cDNA w następujących warunkach: 42°C przez 90 minut, 95°C przez 5 minut i 4°C w zawieszeniu. Ustawić objętość reakcji na 20 μl. Rozpocznij przebieg RT.
2. Pierwsza runda PCR
- Odczynniki PCR wymienione w Tabeli 2 należy przechowywać na lodzie w czystym pomieszczeniu do czasu użycia, a następnie rozmrozić je i zwirować.
- Przygotować mieszaninę PCR pierwszej rundy w probówce PCR o pojemności 0,2 ml z odczynnikami wymienionymi w Tabeli 2.
- Dodaj próbkę cDNA lub plazmidu o objętości 2 μl do mieszaniny PCR pierwszej rundy w stacji roboczej PCR w pomieszczeniu z szablonami. Kontrolą dodatnią PCR jest cDNA CVS-11 przygotowane w sposób opisany w kroku 1.3 dla powyższej metody RT. Ujemna kontrola PCR to dd H2O.
- Przenieść uszczelnione probówki do termocyklera PCR i poddać cyklowi zgodnie z parametrami wymienionymi w tabeli 3.
3. Druga runda PCR
- Przygotować drugą rundę mieszaniny PCR w probówce PCR o pojemności 0,2 ml, używając odczynników wymienionych w Tabeli 4.
- Dodać 2 μl produktu PCR pierwszej rundy do mieszanki PCR w drugiej rundzie. Ponadto należy uwzględnić ddH2Ojako negatywną kontrolę drugiej rundy PCR.
- Wykonaj cykl termiczny PCR, używając tych samych parametrów, które podano w kroku 2.4.
Tabela 1: Odczynniki odwrotnej transkrypcji do syntezy cDNA.
| składnik | Objętość na reakcję (μl) |
| dNTP (2,5 mM) | 4 |
| Podkład losowy (50 μM) | 1,5 |
| Oligo(dT) 15 (50 μM) | 0,5 |
| Bufor M-MLV (5x) | 4 |
| Odwrotna transkryptaza M-MLV (200 j.m./μl) | 1 |
| RNazyna (40 j.m./μl) | 1 |
| Całkowita objętość | 12 |
Tabela 2: Odczynniki pierwszej rundy PCR.
pkt.
| składnik | Objętość na reakcję (μl) |
| dNTP (10 mM) | 1 |
| Ex-Taq (5 U/μL) | 0,3 |
| Bufor Taq (10x) | 5 |
| N127 (20 μM) | 1 |
| N829 (20 μM) | 1 |
| dd H2O | 39,7 |
| Całkowita objętość | Rozdział 48 |
Tabela 3: Parametry cykliczne pierwszej i drugiej rundy PCR
Rozdział
Rozdział
Rozdział
| temperatura | Godzina | cykl |
| 94 °C | Czas trwania: 2 min | 1 |
| 94 °C | 30 sekund | 35 |
| 56 °C | 30 sekund | 35 |
| 72 °C | 40 sekund | 35 |
| 72 °C | Czas trwania: 10 min | 1 |
| 4 °C | ∞ | |
Tabela 4: Odczynniki drugiej rundy PCR.
pkt.
| składnik | Objętość na reakcję (μl) |
| dNTP (10 mM) | 1 |
| Ex-Taq (5 U/μL) | 0,3 |
| Bufor Taq (10x) | 5 |
| N371F (20 μM) | 1 |
| N371R (20 μM) | 1 |
| dd H2O | 39,7 |
| Całkowita objętość | Rozdział 48 |