Artykuł metodologiczny

PCR z topnieniem w wysokiej rozdzielczości w celu określenia zmian sekwencji w zmutowanych sekwencjach DNA

8 lipca 2025

W tym artykule

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Kisserli, A., et al. Wysokorozdzielczy topniejący PCR dla genotypowania polimorfizmu długości receptora dopełniacza 1: innowacyjne narzędzie do oceny podatności genu choroby Alzheimera. J. Vis. Exp. (2017).

W tym filmie opisujemy technikę topnienia PCR o wysokiej rozdzielczości, aby określić polimorfizm długości fragmentów DNA o różnych długościach sekwencji, na podstawie analizy temperatury topnienia.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Protokół HRM-PCR

  1. Rozmrozić próbki DNA. Rozcieńczyć próbki DNA w probówkach o pojemności 1,5 ml wodą, aby dostosować je do stężenia 10 ng/μl
    nuta: Całkowita objętość rozcieńczonego DNA powinna wynosić od 2 μl do 10 μl.
  2. Rozmrozić roztwory podkładu. Rozcieńczyć roztwory starterów w probówkach o pojemności 1,5 ml wodą, aby dostosować je do tego samego stężenia 6 μM.
    nuta: Sekwencje starterów i warunki reakcji przedstawiono w tabeli 1.
  3. Rozmrozić roztwory zestawu HRM-PCR i ostrożnie wymieszać przez wirowanie, aby zapewnić odzyskanie całej zawartości. Przed ich otwarciem krótko odwirować trzy fiolki zawierające mieszaninę enzymatyczną z barwnikiem wiążącym DNA, MgCl2 i wodą. Przechowuj je w temperaturze pokojowej.
  4. W probówce o pojemności 1,5 ml w temperaturze pokojowej przygotuj mieszaninę PCR do jednej reakcji o objętości 20 μl, dodając następujące składniki w kolejności podanej poniżej:
    1. 10 μl mieszaniny enzymatycznej z barwnikiem wiążącym DNA;
    2. 2 μl z 25 mM MgCl2;
    3. 1 μL startera 1,6 μM (stężenie końcowe: 300 nM);
    4. 1 μl startera 2, 6 μM (stężenie końcowe: 300 nM); oraz
    5. 5 μL wody.
      nuta: Aby przygotować mieszaninę PCR dla więcej niż jednej reakcji, należy pomnożyć powyższe objętości przez liczbę reakcji, które mają być przeprowadzone, plus jedną dodatkową reakcję.
  5. Dokładnie wymieszaj, wirując.
  6. Odpipetować 19 μl mieszanki PCR, przygotowanej powyżej, do każdego dołka na białej płytce wielodołkowej.
  7. Dodać 1 μl matrycy DNA o dostosowanym stężeniu.
    nuta: W przypadku reakcji kontrolnych należy zawsze przeprowadzać kontrolę ujemną z próbkami. Aby przygotować kontrolę ujemną, zastąp matrycę DNA wodą.
  8. Uszczelnij białą płytkę wielodołkową folią uszczelniającą.
  9. Umieścić białą płytkę wielodołkową w wirówce i zrównoważyć ją odpowiednią przeciwwagą (tj. inną płytką wielodołkową). Wirować przez 1 minutę przy 1 500 x g w standardowej wirówce z kubełkiem obrotowym zawierającej rotor do płytek wielodołkowych z odpowiednimi adapterami.
  10. Załaduj białą płytkę wielodołkową do instrumentu HRM-PCR.
  11. Rozpocznij program HRM-PCR z następującymi warunkami PCR:
    Denaturacja: 95 °C przez 10 min; 1 cykl.
    Wzmocnienie: 95 °C przez 10 s, 62 °C przez 15 s i 72 °C przez 20 s; 47 cykli.
    Krzywa topnienia: 95 °C; szybkość narastania: 0,02 °C/s; 25 akwizycji na °C; 1 cykl.
    Chłodzenie: 40 °C przez 30 s; szybkość narastania 2,2 °C/s; 1 cykl.

figure-protocol-1

Tabela 1: Startery i parametry używane w analizie topnienia w wysokiej rozdzielczości.

2. Analiza HRM w celu określenia polimorfizmu długości CR1

UWAGA: Opisana metodologia (Rysunek 1) jest specyficzna dla naszego oprogramowania (Zobacz Spis Materiałów), chociaż mogą być używane inne pakiety oprogramowania.

  1. Otwórz oprogramowanie do skanowania genów, aby przeprowadzić analizę skanowania polimorfizmu długości CR1.
  2. Otwórz eksperyment zawierający program amplifikacji i program krzywej topnienia.
  3. Kliknij opcję Edytor próbek na pasku modułu, a następnie wybierz przepływ pracy Skanowanie.
  4. Określ właściwości próbek (tj. nazwę, kontrolę nieznaną lub ujemną).
  5. Kliknij opcję Analiza na pasku modułu.
  6. Z listy Create New Analysis (Utwórz nową analizę) wybierz opcję Gene Scanning (Skanowanie genów).
  7. Kliknij kartę Normalizacja, aby znormalizować krzywe topnienia.
  8. Kliknij kartę Przesunięcie temperatury, aby zresetować oś temperatury (oś x) krzywych topnienia.
    nuta: Dolny wykres przedstawia krzywe topnienia, które są zarówno znormalizowane, jak i przesunięte pod względem temperatury.
  9. Kliknij przycisk Oblicz, aby przeanalizować wyniki i określić grupowanie.
  10. Kliknij kartę Wykres różnicowy w obszarze wykresów, aby wyświetlić krzywe topnienia znormalizowanej i przesuniętej oraz wykres różnicy znormalizowanej i przesuniętej temperatury.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Rysunek 1: Zrzuty ekranu interfejsu graficznego oprogramowania użytego w kroku 2 protokołu. (A) Otwórz oprogramowanie do skanowania genów. (B) Program amplifikacji i program krzywej topnienia. (C) Kliknij Edytor próbek na pasku modułów. (D) Wybierz opcję Scanning (Skanowanie). (E) Określ właściwości pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Fartuch laboratoryjnyochrona
SensiCareBezpudrowe rękawice nitrylowe do badańMedline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, Stany Zjednoczone486802Ochrona próbki
Pipeta Eppendorf Reference 2, 0,5-10 μlEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Francja4920000024Pipetowanie próbek
Pipeta Eppendorf Reference 2, 20-100 μLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Francja4920000059Pipetowanie próbek
Pipeta Eppendorf Reference 2, 100-1000 μLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Francja4920000083Pipetowanie próbek
TipOne 10μL z podziałką, końcówka filtraStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, NiemcyS1121-3810Pipetowanie próbek
TipOne 1-100μL fazowany, końcówka filtra Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, NiemcyS1120-1840Pipetowanie próbek
ART 1000E Końcówka barierowaThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Francja2079EPipetowanie próbek
Probówki Eppendorf Safe-Lock, 1,5 ml, jakość EppendorfEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Francja30120086mieszać
Wir-Dżin 2Scientific Industries, Inc, Bohemia, Nowy Jork 111716, Stany ZjednoczoneSI-0236mieszać
Wirówka Mikro 200Hettich Zentrifugen, D-78532, Niemcy0002020-02-00Wirowania
Multipette E3Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Francja4987000010dystrybucja
Light Cycler 480 płytka wielodołkowa 96, białaRoche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Niemcy4729692001miejsce reakcji
Folia uszczelniająca Light Cycler 480Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Niemcy4429757001Pokrycia
LightCycler 480 Instrument II, 96-dołkowyRoche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Niemcy05015278001Reakcja łańcuchowa polimerazy topniejącej o wysokiej rozdzielczości
Wirówka Heraeus Megafuge 11RThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Francja75004412Wirowania
LightCycler 480 Mistrz topienia o wysokiej rozdzielczościRoche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Niemcy04909631001odczynniki reakcyjne
Podkład CN3: 5'ggccttagacttcctgc 3'Eurogentec Biologics Division, B4102 Seraing, Belgiaodczynnik reakcyjny
Podkład CN3re: 5'gttgacaaattggcggcttcg 3'Eurogentec Biologics Division, B4102 Seraing, Belgiaodczynniki reakcyjne
oprogramowanie light cycler 480 SW 1.5.1Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Niemcyoprogramowanie służące do analizy danych polimorfizmu HRM-PCR CR1
powiedział:

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Polimorfizm DNAanaliza krzywej topnieniaprotok PCRanaliza fragment w DNAfluorescencyjny barwnik raportuj cygenotypowanie CR1biologia molekularna

Powiązane artykuły