Reakcja łańcuchowa polimerazy kropelkowej Multiplex w celu wykrycia metylacji DNA w leukocytach

Streszczenie

Źródło: Malic, L., et al. Specyficzny dla metylacji multipleksowy PCR kropelkowy przy użyciu generatora kropel polimerowych do diagnostyki hematologicznej.J. Vis. Exp. (2020)

Ten film demonstruje technikę reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej multipleksowej do jednoczesnej kwantyfikacji regionów metylowanego DNA w różnych populacjach białych krwinek jako wczesnego biomarkera dla diagnozy klinicznej i prognozowania.

Protokół

1. Wytwarzanie kropelek i PCR

UWAGA: Tabela 1 przedstawia informacje o starterach do przodu i do tyłu wraz z podwójnie hartowanymi sondami hydrolizy dla genów C-LESS, CD3Z i Foxp3, które są wymagane do multipleksowej amplifikacji celów demetylowanych genów.

1. Przygotować mieszankę wzorcową zgodnie z opisem w tabeli 2.
2. Rozmrozić wszystkie składniki mieszanki wzorcowej z wyjątkiem mieszaniny enzymatycznej. Dokładnie wymieszaj mieszankę główną, pipetując góra-dół, a następnie krótko odwiruj.
3. Dodać odpowiednią objętość (1 μl) DNA przekształconego w wodorosiarczyn do mieszanki głównej w probówce do PCR. Wymieszać reakcję, pipetując góra-dół i krótko odwirować.
4. Podłącz jednorazowy przewód płynowy (średnica wewnętrzna 0,25 mm, średnica zewnętrzna 1,6 mm) do dwóch precyzyjnych szklanych strzykawek (objętość 250 μl) za pomocą złączek PEEK.
5. Napełnij jedną precyzyjną szklaną strzykawkę 250 μl oleju nośnikowego zawierającego 5% fluoro-surfaktantu.
6. Przed załadowaniem 100 μl mieszanki PCR należy wstępnie napełnić kolejną precyzyjną szklaną strzykawkę 50 μl oleju nośnikowego, aby zapewnić dozowanie całej objętości próbki podczas emulgacji.
7. Ustaw kropelkowe urządzenie mikroprzepływowe na stoliku pionowego mikroskopu świetlnego wyposażonego w szybką kamerę, aby obserwować i rejestrować powstawanie kropel w czasie rzeczywistym.
8. Umieścić ampułkostrzykawki na programowalnej pompie strzykawkowej i za pomocą złączki PEEK ze złączkami (patrz Tabela materiałów) podłączyć rurki strzykawek do przewodów odpowiednich kanałów wlotowych kropelkowego urządzenia mikroprzepływowego.
9. Umieść rurkę z wylotu generatora kropel w probówce PCR o pojemności 0.5 ml.
10. Dostosować natężenie przepływu pompy strzykawkowej do 2 μl/min i pozwolić, aby wielkość kropli ustabilizowała się przed zebraniem powstałej emulsji.
11. Zebrać emulsję i przenieść 75 μl do probówki PCR o pojemności 0,2 ml w celu przeprowadzenia cykli termicznych.
12. Upewnij się, że zawartość oleju w probówce PCR ściśle odpowiada objętości fazy rozproszonej, aby zapobiec koalescencji kropelek podczas cykli termicznych.
13. Umieścić probówkę PCR o pojemności 0,2 ml w termocyklerze i wykonać protokół cykliczny w następujący sposób: podgrzewanie w temperaturze 95 °C przez 5 minut, następnie 45 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 15 s i wyżarzanie/przedłużanie w temperaturze 60 °C przez 30 s.

Tabela 1: Konstrukcja sondy gruntującej i hydrolizy.

C

FOXP3 Naprzód	GGG TTT TGT TGT TAT AGT TTT TG
FOXP3 Rewers	TTC TCT TCC TCC ATA ATA TCA
CD3Z do przodu	GGA TGG TTG TGG TGA AAA GTG
CD3Z Rewers	CAA, AAA, CTC, CTT, TCT, TCC, TAA, CCA
C-LESS do przodu	TTG TAT GTA TGT GAG TGT GGG AGA GA
C-LESS Rewers	TTT CTT CCA CCC CTT CTC TTC C
Sonda FOXP3	/56-FAM/CA ACA CAT C/ZEN/C AAC CAC CAT /3IABkFQ/
Sonda CDZ3	/56-HEX/CC AAC CAC C/ZEN/A CTA CCT CAA /3IABkFQ/
Sonda bezprądowa	/56-CY5/CT CCC CCT C/ZEN/T AAC TCT AT/3IABkFQ/

Tabela 2: Receptura mieszanki wzorcowej dla mdPCR.

Odczynnik	Roztwór podstawowy	Głośność miksu głównego	Koncentracja robocza
Tris-HCl	1 mln	2 μl	20 mM
Kcl	1 mln	10 μL	100 mM
MgCl2	25 mM	16 μL	4 mM
Podkłady C-LESS	10 μM	10 μL	1 μM każdy
Podkłady CD3Z	10 μM	10 μL	1 μM każdy
Podkłady FOXP3	10 μM	10 μL	1 μM każdy
Sonda C-LESS	10 μM	5 μL	500 nM
Sonda CD3Z	10 μM	5 μL	500 nM
Sonda FOXP3	10 μM	5 μL	500 nM
Polimeraza DNA HotStarTaq	5 jednostek/μL	8 μL	0,4 jednostki/μl
Cel DNA traktowany wodorosiarczynem	zmienna	zmienna	zmienna
Woda wolna od nukleaz		zmienna
Całkowita objętość		100 μL

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówka do PCR	Bio-Rad, Mississauga, ON	TFI0201
Fluoro-surfaktant	RAN Biotechnologies, Beverly, Massachusetts	008-FluoroSurfaktant
Jednorazowe rurki przepływowe	dolomit	3200063
Jednorazowe rurki przepływowe	dolomit	3200302
Kształtki PEEK	IDEX Health & Science, Oak Harbor, Waszyngton	Zobacz materiał P-881
Olej nośnikowy	3M, Św. Paweł, MN
Pionowy mikroskop świetlny	Nikon, Melville, Nowy Jork