$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Kontrola jakości genomowego DNA
UWAGA: Genomowe DNA (gDNA) zostało wyekstrahowane z krwi obwodowej przy użyciu dobrze znanej metody oczyszczania DNA opartej na błonie krzemionkowej. Przed poniższymi procedurami oznaczono stężenie gDNA za pomocą spektrofotometru.
- Przygotuj próbkę gDNA o stężeniu 10-100 ng/μL.
- Dodać 10 μl buforu próbki DNA do paska z 8 probówkami.
- Dodać 1 μl drabinki DNA lub gDNA do probówek. Mieszaj mieszaninę przez 1 minutę za pomocą nasadki do mikropłytki.
- Załaduj probówkę, urządzenie żelowe i końcówki pipet do przyrządu do elektroforezy (Tabela materiałów) i rozpocznij bieg, naciskając przycisk 'Start'.
UWAGA: System elektroforezy zadziała automatycznie po jednym kliknięciu przycisku Start.
- Upewnij się, że dolny marker zawarty w buforze próbki DNA jest prawidłowo przypisany do elektroferogramów. Jeśli jest nieprawidłowo przypisany, ręcznie przypisz znacznik w trybie "Electroherogram mode" oprogramowania.
UWAGA: Liczba integralności DNA (DIN) zostanie obliczona automatycznie. Wartość DIN wynika z integralności DNA. Wysokie i niskie wartości DIN wskazują odpowiednio na wysoce nienaruszone i silnie zdegradowane gDNA.
- Określ region wielkości gDNA (> 200 pz) w trybie "Region mode" oprogramowania, aby automatycznie obliczyć stężenie gDNA (> 200 pz).
2. Projekt podkładu i sondy
- Oblicz wartości temperatury topnienia (Tm) za pomocą dowolnego narzędzia o otwartym dostępie w następujących warunkach: 10-25 zasad, 50 mM Na+/K+, 0,80 mM dNTP i 3 mM Mg2+ (Tabela materiałów). Zaprojektuj startery do przodu i do tyłu, aby amplifikować region genomowy zawierający allele docelowe o wartości Tm około 60 °C i długości amplikonu 100-300 pz.
UWAGA: Patrz Tabela 1 dla stężenia oligonukleotydów.
- Zaprojektuj sondy z zablokowanymi kwasami nukleinowymi (LNA) dla alleli odniesienia i wariantu w oparciu o następujące warunki: (i) w każdej sondzie znajduje się 1-6 LNA; (ii) barwnik fluorescencyjny i wygaszacz są obecne odpowiednio na końcach 5′ i 3′ każdej sondy; (iii) różnica między wartościami Tm dopasowanych i niedopasowanych sond wynosi > 10 °C; (iv) Wartości Tm dopasowanych i niedopasowanych sond są odpowiednio wyższe i niższe niż wartości starterów [e.g., starter do przodu: 60,8 °C, starter odwrotny: 59,8 °C, sonda alleli odniesienia (dopasowana/niedopasowana): 62,6/45,3 °C, sonda allelu wariantowego (dopasowana/niedopasowana): 61,7/50,5 °C]. Wartości Tm zostały obliczone przy użyciu narzędzia otwartego dostępu, które zostało również użyte w kroku 2.1.
- Upewnij się, że projektowane startery i sondy nie obejmują polimorfizmów pojedynczego nukleotydu z częstością > 0,1%, jak określono na podstawie baz danych [e.g., bazy danych polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (dbSNP)].
3. Cyfrowy PCR
- Przygotować startery, sondy i roztwory podstawowe gDNA w stężeniach opisanych w Tabeli 1 z buforem TE i przechowywać je w temperaturze -20–4 °C.
- Zmieszać odczynniki w temperaturze pokojowej w całkowitej objętości 15 μl do końcowego stężenia opisanego w tabeli 1.
- Dodaj 3 μl wody destylowanej zamiast gDNA w kontroli bez matrycy (NTC).
- Przygotować 3,5 razy większą ilość mieszaniny PCR w trzech egzemplarzach, aby uwzględnić błąd pipetowania.
- Pipetować mieszaninę PCR w górę iw dół, aby ją wymieszać.
- Ustaw platformę załadowczą na wiórach wbudowanych w 8-rurkową listwę i ustaw je na autoloaderze. Upewnij się, że wiór styka się z platformą ładunkową.
- Zamontuj suwak załadunkowy na platformie i przytrzymaj suwak z ogranicznikiem poza ładowarką.
- Odpipetować 15 μl mieszaniny PCR na platformie w pobliżu końcówki suwaka (Rysunek 1A).
- Uruchom ładowarkę, naciskając przycisk ładowarki (na około 1 min).
UWAGA: Nie stanowi problemu, jeśli na platformie pozostanie niewielka ilość mieszaniny PCR. Możliwe jest sekwencyjne ponowne uruchamianie programu ładującego.
- Umieść chip-in-a-tube wypełnioną mieszaniną PCR w bocznej szczelinie wzmacniacza uszczelnienia. Naciśnij przesuwaną pokrywę i krawędź górnej pokrywy, aby nie złamać chipa (Rysunek 1B).
- Uruchom wzmacniacz uszczelniający (około 2 min). Sekwencyjnie uruchamiaj wzmacniacz uszczelniający przez 1 minutę, jeśli kałuża płynu jest nadal widoczna, ponieważ niepełne uszczelnienie powoduje zanieczyszczenie krzyżowe sygnałów dodatnich (Rysunki 1C i 1D).
- Dodać 230 μl płynu uszczelniającego, odczynnika na bazie oleju, do probówek.
UWAGA: Frytki powinny być teraz zanurzone w płynie.
- Ustaw rurki w termocyklerze. Uruchom termocykler zgodnie z opisem w Tabela 2 (na około 2 godziny). Dostosuj temperaturę lub czas trwania PCR, jeśli występuje nierównomierny rozkład dodatnich partycji (Rysunek 1E).
UWAGA: Zaleca się ustawienie szybkości narastania na około 1 °C/s.
- Pozostaw probówki w termocyklerze na co najmniej 15 minut, aby zmniejszyć hałas linii podstawowej.
UWAGA: Probówki można również zostawić na noc. Sygnały fluorescencyjne były wykrywane nawet następnego dnia.
- Ustaw probówki na przyrządzie detekcyjnym i wlej do niego 6 ml wody destylowanej. Jeśli wewnątrz i na zewnątrz rur widoczne są pęcherzyki powietrza, usuń je (Rysunki 1F i 1G).
- Załaduj przyrząd do detektora i uruchom go, klikając przycisk "Uruchom" w oprogramowaniu po wybraniu zakładek Fluorescencja, Eksperyment i Próbka/NTC (Tabela materiałów).
UWAGA: Detekcja dwóch kolorów ośmiu próbek o domyślnej intensywności zajmuje około 4 - 5 minut.
- Potwierdź wykres pozycji, histogram i wykres punktowy 2D.
UWAGA: Jeśli intensywność fluorescencji przegród ujemnych jest wysoka, dostosuj intensywność, klikając przycisk Ustawienia w oprogramowaniu, tak aby mieściła się w zakresie 30-70.
- Oblicz frakcję allelu wariantowego (VAF) za pomocą następującego wzoru:
Tutaj Cv i Cr są numerami kopii odpowiednio wariantu i allelu referencyjnego.
UWAGA: Są one automatycznie obliczane w programie na podstawie statystyk Poissona.
4. Kolekcja produktów PCR
- Usuń płyn uszczelniający z rurki.
- Dodać 100 μl buforu TE do probówki. Wirować energicznie przez 30 s i krótko odwirować probówkę.
- Przenieść roztwór TE do innej probówki i dodać 30 μl 3 M octanu sodu i 200 μl etanolu.
- Schłodzić roztwór w temperaturze -20 °C przez noc.
- Odwirować roztwór przez 30 minut przy 16 000 x g i usunąć supernatant.
- Dodaj 300 μl 80% etanolu do probówki i odwiruj.
- Odwirować roztwór przez 15 minut przy 16 000 x g i usunąć supernatant. Pozostaw osad do wyschnięcia na powietrzu przez 5 minut.
- Rozpuścić osad w 1–5 μl buforu TE po wysuszeniu na powietrzu.
- W razie potrzeby oceń rozmiar produktu za pomocą przyrządu do elektroforezy w odniesieniu do kroku 1. Załaduj 1 μl roztworu do urządzenia żelowego, aby uzyskać wysoką czułość (Tabela materiałów).
