Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
UWAGA: Ta procedura jest specjalnie zaprojektowana do wykrywania małej liczby cząsteczek cDNA w świeżo zamrożonych tkankach ludzkich. Skrawki tkanek zostały wycięte na suchym lodzie, gdy były jeszcze zamrożone, z wcześniej zwalidowanych próbek guza żołądka lub normalnych tkanek pochodzących od pacjenta.
1. Izolacja i oczyszczanie RNA
- Ekstrakcja RNA
nuta: Izolację RNA przeprowadza się pod maską przy użyciu określonego produktu (patrz Tabela materiałów). Jednak na rynku dostępnych jest wiele zestawów izolacyjnych.
- Homogenizować 50 - 100 mg drobno pokrojonej, świeżo zamrożonej próbki tkanki w probówce o pojemności 1,5 ml z 1 ml odczynnika do izolacji RNA i energicznie wirować przez 15 s. Inkubować probówki w temperaturze -80 °C przez noc.
- Inkubować probówkę zawierającą próbkę w temperaturze pokojowej przez 5 minut i mieszać przez wirowanie przez 15 sekund.
- Trzymaj probówkę na lodzie, dodaj 200 μl chloroformu i energicznie wiruj przez 15 sekund.
- Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez 60 s i odwirowywać je przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
- Przenieść fazę wodną do probówki o pojemności 1,5 ml i dodać 20 μg glikogenu.
nuta: Ważne jest, aby ostrożnie unikać przenoszenia jakichkolwiek warstw interfazowych lub organicznych w celu zmniejszenia zanieczyszczenia.
- Dodać 500 μl izopropanolu, odwracając probówkę do wymieszania i inkubować na lodzie przez 10 minut.
- Odwirować probówkę o stężeniu 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu wytrącenia RNA.
nuta: RNA będzie obecne w żelowym granulie z boku i na dole probówki, często niewidocznym po odwirowaniu.
- Usunąć supernatant bez naruszania osadu i przemyć go 1 ml 75% etanolu przez pipetowanie.
- Odwirować probówkę o stężeniu 7 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant bez naruszania osadu.
- Pozostaw osad do wyschnięcia, aż osad stanie się przezroczysty i rozpuść go w 50 μl wody wolnej od RNaz.
- Próbki należy zamrozić w temperaturze -80 °C co najmniej przez noc przed oznaczaniem ilościowym.
- Eliminacja genomowego DNA i oczyszczanie RNA
nuta: Etap trawienia DNazy, po którym następuje oczyszczanie RNA za pomocą kolumny, jest zalecany do analiz celów o niskiej liczebności w celu strawienia zanieczyszczającego DNA.
- Rozpuścić liofilizowaną DNazę I (1 500 jednostek Kunitza) w 550 μl wody wolnej od RNaz za pomocą strzykawki, delikatnie wymieszać przez odwrócenie fiolki i podzielić odtworzony roztwór podstawowy na podwielokrotności.
- Przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml obliczoną objętość próbki z 15 μg RNA, 10 μl buforu do wytrawiania DNazy z zestawu (wymienionego w tabeli materiałów), 2,5 μl roztworu podstawowego DNazy I i wodą wolną od RNaz do 100 μl. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min.
- Dodać 350 μl buforu do lizy tkanek (z zestawu, patrz tabela materiałów) i wymieszać przez pipetowanie.
- Dodać 250 μl 100% etanolu i wymieszać pipetując.
- Przenieść całą objętość (700 μl) do nowej kolumny wirowej i odwirować przy 12 000 x g przez 15 sekund.
- Przenieść filtr do nowej probówki zbiorczej, dodać 500 μl 80% etanolu do kolumny i odwirować przy 12 000 x g przez 2 minuty.
- Otworzyć pokrywę kolumny wirującej i odwirować przy 12 000 x g przez 5 minut z nową probówką zbiorczą w celu wysuszenia filtra, a następnie przenieść filtr do probówki o pojemności 1,5 ml.
- Dodać 14 μl wody wolnej od RNaz bezpośrednio do kolumny filtracyjnej i odwirować przy 12 000 x g przez 1 min.
- Próbki należy przechowywać na lodzie i przystąpić do oznaczania ilościowego przy użyciu 2 μl próbki na spektrofotometrze laboratoryjnym lub przechowywać RNA w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
2. Konfiguracja cyfrowej reakcji PCR
- Mieszanie reakcyjne dPCR i przygotowanie próbki
- Rozmrażać mieszankę wzorcową i test w temperaturze pokojowej przez co najmniej 20 minut.
- Rozcieńczyć próbki cDNA do stężenia 300 ng w 6 μl wody.
- Delikatnie zmieszaj mieszankę wzorcową i przygotuj ją w sterylnej probówce z 8,7 μl mieszanki wzorcowej, 0,87 μl specjalnie zaprojektowanego startera testowego CDH1a i 1,83 μl wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać końcową objętość 11,4 μl.
nuta: Szczegółowe informacje na temat specjalnie zaprojektowanego startera testowego CDH1a znajdują się w Tabeli materiałów.
- Przenieść 11,4 μl przygotowanej mieszaniny do rozcieńczonej próbki cDNA, delikatnie wymieszać i krótko odwirować.
nuta: Objętości zawierają 20% nadwyżki, aby skompensować utratę objętości spowodowaną pipetowaniem. Przygotować mieszaninę dla wszystkich próbek i kontroli bez matrycy (NTC).
- Przygotowanie wiórów
Uwaga: Aby uzyskać optymalne wyniki, załaduj żetony tak szybko, jak to możliwe.
- Podłącz ładowarkę wiórów i poczekaj, aż kontrolka zmieni kolor na zielony.
- Zdjąć nasadkę strzykawki z płynem zanurzeniowym, delikatnie odciągając tłok o 1 - 2 mm i zwalniając go, aby ułatwić ten krok, a następnie zastąpić go końcówką.
- Weź nowy chip i zanotuj kod napisany na pokrywie, aby skojarzyć go z próbką.
- Chwyć ostrożnie pokrywkę za bok, zdejmij folię ochronną i umieść pokrywkę lepką stroną do góry we właściwej orientacji.
- Ostrożnie podnieś wiór, uważając, aby nie dotknąć części wewnętrznej, i załaduj go do gniazda wiórów we właściwej pozycji, naciskając dźwignię, aby otworzyć zacisk.
- Załaduj nowy nóż załadowczy na ładowarkę i delikatnie go popchnij, aby upewnić się, że jest dobrze osadzony.
- Przenieś 14,5 μl mieszaniny reakcyjnej dPCR na ostrze ładujące bez tworzenia pęcherzyków powietrza lub odchylania ostrza, po czym naciśnij przycisk ładowania, aby rozprowadzić objętość na chipie.
- Użyj strzykawki z płynem zanurzeniowym, aby przenieść około 20 kropli na powierzchnię wióra, uważając, aby nie dotknąć powierzchni końcówką.
nuta: Ważne jest, aby pokryć całą powierzchnię bez rozlewania płynu na krawędzie.
- Obróć ramię ładowarki, aby pokrywa zetknęła się z wiórem i dociśnij przez 15 sekund.
- Naciśnij przycisk pokrywy, aby zwolnić chip i przywrócić ramię do pozycji.
- Przytrzymaj zmontowany chip pod kątem 45° i ostrożnie dozuj płyn zanurzeniowy za pomocą strzykawki przez otwór napełniania, lekko obróć chip, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza, i usuń nadmiar płynu sterylną chusteczką.
- Uszczelnij pojemnik na wióry, delikatnie odklejając etykietę na górze pokrywy chipsów i dociśnij port napełniania przez co najmniej 5 sekund.
- Przechowuj chip w ciemności, aż będzie gotowy do załadowania do termocyklera.
nuta: Przygotowane chipsy należy zużyć w ciągu 2 godzin.
- Reakcja dPCR
- Otwórz pokrywę i zainstaluj adaptery do obu bloków, nawet jeśli używany jest jeden blok.
- Umieść wióry na bloku próbki we właściwej pozycji.
nuta: Port napełniania musi być skierowany do przodu termocyklera w pozycji podniesionej, aby umożliwić wszelkie pęcherzyki powietrza unoszenie się do góry bez naruszania okienka chipa. Użyj pustych żetonów, aby zrównoważyć dwa bloki.
- Połóż podkładkę termiczną na bloku próbki, aby całkowicie zakryć wióry.
- Zamknąć pokrywę i rozpocząć przebieg PCR, stosując następujące warunki: utrzymać w temperaturze 96 °C przez 10 minut; 45 cykli po 60 °C przez 2 minuty i 98 °C przez 30 s; utrzymać w temperaturze 60 °C przez 2 minuty; utrzymać w temperaturze 4 °C. Wyłączyć termocykler i rozmrażać wióry w temperaturze pokojowej przez co najmniej 10 minut.
nuta: Analizę wiórów należy przeprowadzić w ciągu jednej godziny.
- Analiza wiórów
- Otwórz pokrywę instrumentu i wyjmij podkładki termiczne, a następnie wyjmij wióry z adapterów.
nuta: Przechowuj wióry w ciemnym, czystym miejscu do czasu analizy.
- Oczyść powierzchnię wióra izopropanolem i sterylną chusteczką.
nuta: Sprawdź każdy chip pod kątem wycieków lub potencjalnych problemów.
- Podłącz USB do systemu detektora, aby zapisać dane.
- Otwórz tackę na wióry w systemie detektora, załaduj chip stroną zadrukowaną do góry we właściwej pozycji, a następnie zamknij tackę.
- Poczekaj 30 s na przetworzenie, a następnie wyjmij chip i włóż następny.
- Poczekaj na zakończenie analizy dla wszystkich przetworzonych chipów, a następnie włóż USB do komputera, aby przesłać pliki.
nuta: Całkowity czas analizy wynosi około 2 do 3 minut/chip.
3. Analiza i interpretacja danych
- Połącz się z platformą oprogramowania opartą na chmurze, która jest niezbędna do przeprowadzenia wszystkich dalszych analiz.
- Utwórz projekt i zaimportuj wszystkie pliki danych interesujących Cię chipów.
- Wprowadź nazwę próbki, wybierz barwnik i test użyte w zakładce "Zdefiniuj wióry".
- Określ, czy chip jest akceptowalny, wizualizując go w zakładce "Review Data", sprawdzając, jak dokładnie próbka została załadowana do chipa i ile punktów danych jest możliwych do oceny.
nuta: Odrzucaj chipy z mniej niż 13 000 punktów danych podlegających ocenie.
- Przejdź do wykresu punktowego wybranego chipa po prawej stronie ekranu; zastosuj próg 6,000 dla sygnałów barwnika reporterowego amidytu fluoresceiny (FAM) (oś Y) do wszystkich chipów.
nuta: Konfiguracja progów może się różnić w zależności od zastosowanych testów.
- Usuń wszelkie wątpliwe sygnały pozytywne, aby zapobiec fałszywie dodatnim wynikom, wybierając względne miejsce na wykresie punktowym za pomocą narzędzia lasso i naciskając "nieokreślone". Wszystkie pozostałe dodatnie plamy wskazują na obecność kopii cDNA rzadkiego analizowanego celu.
