Cyfrowy PCR oparty na chipie do wykrywania rzadkich wariantów transkryptu za pomocą chipa nanofluidycznego

Abstract

Źródło: Molinari, C., et al. Wykrywanie rzadkiego wariantu transkryptu CDH1 w świeżo mrożonych tkankach raka żołądka za pomocą cyfrowego PCR opartego na chipie. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film demonstruje cyfrowy PCR oparty na chipie — odmianę techniki cyfrowego PCR, która jest przydatna w wykrywaniu rzadkich wariantów transkryptu. Reakcja PCR jest podzielona na komory nanofluidycznego chipa, z których każdy działa jak niezależna reakcja. Detekcja sygnałów fluorescencyjnych z komór ze wzmocnionymi celami potwierdza obecność w próbce rzadkich wariantów transkryptu.

Protocol

Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.

UWAGA: Ta procedura jest specjalnie zaprojektowana do wykrywania małej liczby cząsteczek cDNA w świeżo zamrożonych tkankach ludzkich. Skrawki tkanek zostały wycięte na suchym lodzie, gdy były jeszcze zamrożone, z wcześniej zwalidowanych próbek guza żołądka lub normalnych tkanek pochodzących od pacjenta.

1. Izolacja i oczyszczanie RNA

1. Ekstrakcja RNA

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Odczynnik TRIazol	Thermo Fisher Naukowy	15596018
Glikogen 20 mg/ml	Roche	10901393001
Zestaw do czyszczenia RNeasy MinElute	QIAGEN powiedział:	Numer katalogowy: 74204
Zestaw do syntezy cDNA iScript	Przedsiębiorstwo BioRad	1708891
QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2	Thermo Fisher Naukowy	Nr kat. A26358
Niestandardowy test CDH1a IDT	Zintegrowane technologie DNA (IDT)	nie	f) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [Stężenia zoptymalizowane w teście dPCR: 900 nM (F), 900 nM (R), 250 nM (P)]
Zestaw chipów QuantStudio 3D Digital PCR 20K v2	Thermo Fisher Naukowy	Nr kat. A26316
Fresk Heraeus Biofuge	Thermo Scientific	75002402
Termocykler (Labcycler)	Sensoquest (Sensoquest)	011-103
System PCR GeneAmp 9700	Thermo Fisher Naukowy	N805-0200
Moduł próbki z podwójnym płaskim blokiem	Thermo Fisher Naukowy	4425757
Podstawa uchylna QuantStudio 3D do systemu GeneAmp PCR z podwójnym płaskim blokiem 9700	Thermo Fisher Naukowy	4486414
QuantStudio 3D Digital PCR Chip Adapter Adapter do płaskiego termocyklera	Thermo Fisher Naukowy	4485513
Cyfrowa ładowarka chipów QuantStudio 3D PCR	Thermo Fisher Naukowy	4482592
Cyfrowy instrument PCR QuantStudio 3D z przewodem zasilającym	Thermo Fisher Naukowy	4489084