Test Dot Blot w celu ilościowego określenia genomu wirusa

UWAGA: Przepisy dotyczące roztworów i potrzebnych do tego protokołu znajdują się w Tabeli 1.

1. Plama punktowa

1. Przygotowanie wzorców plazmidowego DNA
   1. Rozcieńczyć DNA plazmidu genomu wektora AAV do 10 ng / μL w wodzie lub buforze Tris-HCl (10 mM, pH 8,0). Pobrać 25 μl tego rozcieńczenia i trawić odpowiednim enzymem restrykcyjnym przez 1 godzinę w celu linearyzacji plazmidowego DNA w objętości reakcyjnej 50 μl.
      nuta: Wykonujemy zduplikowany zestaw trawienia (patrz krok 1.4.1). Odpowiednim enzymem powinien być taki, który przecina plazmidowe DNA poza obszarem wiążącym sondę dot blot. Dla wygody rozcieńczony plazmidowy DNA można podzielić na porcje (25 μl/probówkę) i przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości. Trawić plazmidowe DNA, gdy probówki drżą w kroku 5.1. Nie trawić nadmiernie wzorca plazmidowego DNA.
   2. Dodać 450 μl wody lub TE do probówki zawierającej wzorzec strawionego plazmidu DNA i dokładnie wymieszać. Przenieść 70 μl tej mieszaniny do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml z 1,330 μl wody lub TE, aby uzyskać rozcieńczony wzorzec plazmidu (25 pg/μL).
   3. Postępuj zgodnie z tabelą 1, aby utworzyć zestaw dwukrotnych rozcieńczeń seryjnych (600 μl/probówkę). Dokładnie wymieszaj rozcieńczenia, wirując przez 5 s.
2. Denaturacja wzorców i próbek DNA wirusa
   1. Dodać 600 μl 2x roztworu alkalicznego do każdego standardowego rozcieńczenia. Dobrze wymieszaj, wirując przez 5 do 10 sekund. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
   2. Dodaj 120 μl 2x roztworu alkalicznego do każdej próbki DNA wirusa. Dobrze wymieszaj, wirując przez 5 do 10 sekund. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
3. Ustawianie aparatu do igłów punktowych
   1. Za pomocą nożyczek przyciąć membranę do bibuły (np. sondy zeta) do rozmiaru odpowiedniego dla liczby próbek i wzorców. Namocz membranę w wodzie przez 10 minut przed umieszczeniem jej na aparacie do plam punktowych. Przykryj nieużywane studzienki na aparacie membranowym.
      nuta: Z membraną należy obchodzić się czystą pęsetą. Aby przykryć puste studzienki, można użyć jasnoniebieskiego arkusza ochronnego, który jest dołączony do membrany. Nie dopuścić do wyschnięcia membrany przed związaniem próbek i wzorców. Więcej informacji na temat montażu i użytkowania urządzenia można znaleźć w instrukcji obsługi.
   2. Dodaj wodę do studni, do których zostaną załadowane próbki. Zastosuj podciśnienie i przeciągnij wodę przez studzienki, aby sprawdzić, czy nie ma błędów i ponownie przetestować po naprawieniu. Ponownie dokręć, jednocześnie stosując podciśnienie, aby zapewnić szczelne uszczelnienie.
      nuta: Niepełne uszczelnienie może spowodować wyciek próbki między studzienkami.
   3. Po całkowitym przeciągnięciu wody całkowicie zwolnij podciśnienie (tj. kolektor podciśnienia powinien być otwarty na ciśnienie powietrza).
4. Ładowanie wzorców i próbek do aparatu do igłowania punktowego
   1. Nałożyć 400 μl każdego rozcieńczonego wzorca plazmidowego DNA do każdej studzienki i uruchomić cztery pasy standardowych rozcieńczeń. Użyj dwóch oddzielnych podwielokrotności standardowego skrótu i załaduj każdą z nich w dwóch egzemplarzach. Zastosować 200 μl/basenik z każdej próbki DNA wirusa.
      nuta: Korzystając z pozostałych ~40 μl zdenaturowanych próbek, można przygotować rozcieńczone próbki (np. 10-krotnie rozcieńczone próbki przy użyciu 20 μl próbki plus 180 μl 1x roztworu alkalicznego) i w razie potrzeby osuszyć.
   2. Zastosuj delikatną próżnię, aby przeciągnąć roztwory DNA przez studzienkę.
      nuta: Podciśnienie należy wyregulować poprzez częściowe otwarcie zaworu trójdrogowego, tak aby podciśnienie było przykładane do aparatu do igłówek, a także do atmosfery (tj. z ramionami kranu ustawionymi pod kątem około 45°, gdzie wydaje głośniejszy dźwięk ssania).
   3. Po opróżnieniu wszystkich studzienek uwolnij podciśnienie, regulując zawór trójdrogowy. Dodaj 400 μl 1x roztworu alkalicznego do każdej studzienki, która zawierała wzorce i próbki. Odczekaj 5 minut przed ponownym zastosowaniem próżni w celu opróżnienia studzienek.
   4. Ponownie zastosuj próżnię w ten sam sposób.
   5. Zdemontuj aparat do igrania w punkcie i.pl pod próżnią, usuń membranę i przepłucz ją 2x SSC. Umieść membranę na czystym ręczniku papierowym stroną związaną z DNA skierowaną do góry, aby usunąć nadmiar 2x SSC.
   6. Sieciowanie UV oplamionego DNA z błoną za pomocą odpowiedniego środka sieciującego UV; błona jest teraz gotowa do hybrydyzacji.
      nuta: Mokre membrany mogą być używane do sieciowania UV. Wysuszone, usieciowane promieniami UV membrany mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej. Więcej informacji można znaleźć w Tabeli materiałów.

2. Hybrydyzacja i mycie

1. Rozgrzej bufor hybrydyzacyjny w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C.
2. Enzymatycznie oznacz sondę DNA radioaktywnym ^α-32P dCTP i oczyść ją za pomocą dostępnych na rynku zestawów zgodnie z zaleceniami producenta.
   nuta: Używamy sondy o długości 0,5–2,0 kb z regionu wzmacniająco-promotorowego lub sekwencji kodującej białko w genomie wirusa. Chociaż protokół ten wykorzystuje ³²sondy radioaktywne znakowane P do wykrywania sygnałów, można również użyć nieradioaktywnych sond chemiluminescencyjnych lub fluorescencyjnych (patrz sekcja Dyskusja).
3. Umieść membranę w butelce do hybrydyzacji stroną związaną z DNA do góry, przepłucz membranę 5 ml wstępnie podgrzanego buforu hybrydyzacyjnego i wyrzuć bufor. Następnie dodać 10 ml podgrzanego buforu do hybrydyzacji i umieścić butelkę w obrotowym piecu do hybrydyzacji ustawionym na 65 °C. Obracać przez ≥5 min.
4. Denaturacja termiczna 20 μl 10 mg/ml roztworu DNA nasienia śledzia lub łososia i ^{sonda 32}znakowana P (≥10,7 cpm) przez 5 minut, umieszczając probówki na bloku grzewczym ustawionym na 100 °C. Następnie schładzaj je na lodzie przez ≥2 minuty, krótko wiruj i trzymaj na lodzie do zużycia.
   ostrożność: W przypadku radioaktywnych sond DNA należy użyć probówek o pojemności 1,5 ml z nakrętkami i pierścieniami uszczelniającymi o przekroju okrągłym.
5. Szybko dodaj zdenaturowane DNA plemnika i radioaktywną sondę do buforu hybrydyzacyjnego w butelce do hybrydyzacji i potrząsaj butelką przez 10 sekund, aby wymieszać. Umieścić butelkę z powrotem w piekarniku o temperaturze 65 °C i inkubować butelkę, obracając ją w temperaturze 65 °C przez ≥4 godziny.
6. Po zakończeniu hybrydyzacji zatrzymaj rotację, wyjmij butelkę do hybrydyzacji, a następnie wlej roztwór sondy radioaktywnej do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z szczelną zatyczką. Przechowuj sondę w odpowiednim pojemniku umieszczonym w lodówce przeznaczonej do materiałów radioaktywnych.
   nuta: Zużyty bufor do hybrydyzacji z sondą przechowywaną w temperaturze 4 °C może być ponownie użyty co najmniej 5 razy, umieszczając stożkową probówkę o pojemności 50 ml z szczelną nakrętką uszczelniającą, która zawiera bufor hybrydyzacyjny, w łaźni wodnej o temperaturze 100 °C na 5 minut.
7. Przemyć membranę buforem do płukania podgrzanym do 65 °C. Dodaj 20 do 30 ml buforu do płukania do butelki do hybrydyzacji i obracaj przez 5 minut. Powtórz to pranie jeszcze 2 razy.
   nuta: Zmierz radioaktywność roztworów płuczących i zapisz ją, jeśli jest to wymagane przez lokalny instytut.
8. Podczas mycia membrany umieść ekran obrazowania luminoforowego na gumce obrazu na 5 minut.
9. Po trzecim praniu wyjmij membranę z butelki do hybrydyzacji, usuń nadmiar buforu z membrany ręcznikami papierowymi i umieść membranę w przezroczystym plastikowym uchwycie papierowym. Sprawdź sygnały radioaktywne na membranie za pomocą licznika Geigera. Wystaw wymazany ekran obrazowania luminoforowego na membranie na 10 minut do nocy, w zależności od intensywności sygnału.
10. Zeskanuj ekran za pomocą systemu skanowania obrazu luminoforowego i uzyskaj dane o intensywności sygnału każdej kropki.

Tabela 1: Ilościowe wzorce DNA plazmidu dot blot. Pokazane są niezbędne objętości roztworu wzorcowego DNA plazmidu o stężeniu 25 pg/μL oraz wody lub TE do przygotowania wzorców plazmidowego DNA przez dwukrotne seryjne rozcieńczenia (600 μL/probówkę). Liczby w kolumnie wzorca plazmidowego DNA (0,039 do 5 ng) to ilość DNA w 200 μl każdego roztworu wzorcowego plazmidowego DNA.