1. Przygotowanie próbki
- Weź 50 mg tkanki myszy do probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 200 μl buforu do lizy (50 mM HEPES, pH 7,4, 137 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 10 mM Na2P2O7, 1% Triton X-100, 10% glicerolu), uzupełniony inhibitorami proteazy i fosfatazy (100 mM NaF, 0,1 mM fluorku fenylometylosulfonylu, 5 μg/ml pepstatyny, 10 μg/ml leupeptyny, 5 μg/ml aprotyniny).
- Homogenizować tkankę za pomocą homogenizatora przez 1 minutę na lodzie.
- Wirować przez 10 minut przy 8 000 x g w temperaturze 4 °C.
- Zebrać supernatant do nowych probówek (1,5 ml) i pobrać 1 μl do testu stężenia białka za pomocą zestawu BCA.
UWAGA: Wszystkie powszechnie używane do lizy do analizy western blot i analizy Dot blot mogą być używane do analizy QDB.
2. Określanie swoistości przeciwciała
- Przygotować lizaty próbki (20 μg) w sekcji 1.4, BSA wolne od IgG (20 μg) i białko wzorcowe (600 pg) do analizy western blot.
UWAGA: BSA wolne od IgG stosuje się jako kontrolę ujemną, a standardowe białko jest stosowane jako kontrolę pozytywną. Swoistość przeciwciała wykazuje się poprzez pokazanie jednego pasma o odpowiedniej wielkości za pomocą analizy western blot.
3. Definiowanie zakresu liniowego analizy QDB
- Rozpuścić białko wzorcowe za pomocą ddH2O. Rozcieńczyć białko do stężenia 1 200 pg/μL.
- Rozcieńczyć skoncentrowane białko z przygotowanych próbek w sekcji 1,4-4 μg/μl.
- Rozpuścić BSA za pomocąddH2O. Rozcieńczyć białko do stężenia 1,200 pg/μL i 4 μg/μL.
- Serię rozcieńczeń białka wzorcowego i przygotowanych próbek przygotowano zgodnie z wytycznymi zawartymi w Tabeli 1 i Tabeli 2.
- Wymieszać ze sobą 10 μl rozcieńczonego białka wzorcowego lub przygotowanych do rozcieńczenia próbek i 10 μl 2x bufor ładujący (120 mM Tris-HCl pH 6,8, 20% glicerol, 4% SDS, 0,2% błękit bromfenolowy, 200 mM DTT).
- Podgrzewać mieszaniny w temperaturze 85 °C przez 5 minut.
4. Proces analizy QDB
- Przykładowa aplikacja
- Podeprzyj płytkę QDB, aby spód płyty nie dotykał powierzchni stołu. Na przykład użyj pustego pudełka na końcówki do pipet jako podpory.
- Załadować do 2 μl próbki do środka membrany na dnie pojedynczej jednostki płytki QDB.
- Suszenie talerza
- Pozostawić załadowaną płytkę QDB na 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT) lub alternatywnie pozostawić załadowaną płytkę w temperaturze 37 °C na 15 minut w dobrze wentylowanym pomieszczeniu.
- Blokowanie płyty
- Zanurz płytkę QDB w buforze transferowym (0,039 M glicyna, 0,048 M Tris, 0,37% SDS, 20% alkohol metylowy) i delikatnie potrząsaj płytką przez 10 s.
- Delikatnie opłucz płytkę QDB trzykrotnie TBST (sól fizjologiczna buforowana trisem, 0,1% Tween 20), a następnie myj płytkę przez 5 minut w TBST pod ciągłym wstrząsaniem.
- Zablokować płytkę QDB buforem blokującym (5% mleka beztłuszczowego w TBST (100 μL/basenik) na 1 godzinę przy ciągłym wstrząsaniu.
- Inkubacja przeciwciał pierwotnych
- Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało w buforze blokującym w wybranym stężeniu (od 1: 500 do 1: 5 000) i dodać 100 μl do każdego pojedynczego dołka zwykłej 96-dołkowej płytki. Włożyć płytkę QDB do płytki 96-dołkowej i inkubować połączone płytki przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C przy ciągłym wstrząsaniu.
- Alternatywnie, należy umieścić płytkę QDB w pudełku i wypełnić je buforem blokującym 2 do 3 mm powyżej części membranowej płytki, jeśli to samo przeciwciało jest używane na całej płytce. Dodać pierwszorzędowe przeciwciało o wybranym stężeniu i inkubować płytkę przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C przy ciągłym wstrząsaniu.
- Delikatnie opłucz płytkę TBST trzy razy, a następnie trzykrotnie umyj ją TBST, za każdym razem przez 5 minut pod ciągłym wstrząsaniem.
- Inkubacja przeciwciał wtórnych
- Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w buforze blokującym w wybranym stężeniu (od 1:1 000 do 1:50 000) i albo podwielokrotność 100 μl/basenik na płytce 96-dołkowej, albo w pudełku, jak opisano w sekcji 4.4.2, a następnie inkubować płytkę QDB wewnątrz załadowanej płytki 96-dołkowej lub pudełka przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej przy ciągłym wytrząsaniu.
- Delikatnie opłucz płytkę QDB 3 razy za pomocą TBST, a następnie umyj płytkę 3 razy, po 5 minut za pomocą TBST pod ciągłym wstrząsaniem.
- Kwantyfikacji
- Przygotuj ulepszony substrat chemiluminescencyjny (ECL), postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
- Podwielokrotny substrat ECL umieścić na płytce 96-dołkowej (100 μl/basenik) i włożyć płytkę QDB do płytki 96-dołkowej na 2 minuty pod ciągłym wstrząsaniem.
- Wyjmij płytkę QDB z płytki 96-dołkowej i krótko wstrząśnij, aby usunąć nadmiar płynu. Umieścić płytkę na białej płytce do mikromiareczkowania.
- Włącz czytnik mikropłytek i wybierz "płytkę z pokrywą" w interfejsie użytkownika przed umieszczeniem połączonych płytek (płytka QDB + adapter białej płytki) w czytniku mikropłytek w celu ilościowego określenia.
UWAGA: Upewnij się, że używasz białej, nieprzezroczystej płytki do mikromiareczkowania jako adaptera, aby uniknąć zakłóceń ze strony płytki. Upewnij się, że wybrałeś "płytkę z pokrywą", aby uniknąć zakleszczenia maszyny, gdy połączone płytki (płytka QDB + adapter płytki 96-dołkowej) są umieszczone w czytniku mikropłytek.
Tabela 1. Schemat rozcieńczania dla krzywej białka standardowego.
Rozdział
Rozdział
pkt.
pkt.
pkt.
Rozdział
Rozdział
Rozdział
Rozdział
Rozdział
Rozdział
| S1
(0pg/μl) | S2 (33,3 pg/μl) | S3
(100pg/μl) | S3
(300 pg/μl) | S5
(600 pg/μl) | S6
(1200 pg/μl) |
| Białko standardowe (1200pg/μl) | 0 | Pytanie 1,39 | Rozdział 4.17 | Rozdział 12,5 | 25 | 50 |
BSA
wolne od IgG
(4pg/μl) | 50 | Lokal mieszkalny 48,61 | Z numerem 45,83 | 37,5 | 25 | 0 |
| łączny | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
Tabela 2. Schemat rozcieńczania dla przygotowanych próbek
Rozdział
Rozdział
TGL
pkt.
Rozdział
Rozdział
Rozdział
Rozdział
Rozdział
Rozdział
| X1
(0μg/μl) | X2
(0,25 μg/μl) | X3
(0,5 μg/μl) | X4
(1μg/μl) | X5
(2μg/μl) | X6
(4 μg/μl) |
| Próbka (4μg/μl) | 0 | Pytanie 3,125 | Godzina 6,25 | Rozdział 12,5 | 25 | 50 |
| BSA wolne od IgG (4μg/μl) | 50 | 46.875 | Lokal z numerem 43,75 | 37,5 | 25 | 0 |
| łączny | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
