UWAGA: Ten protokół został zoptymalizowany przy użyciu standardowych, dostępnych na rynku zestawów i odczynników w celu zwiększenia odtwarzalności (zobacz Tabelę Materiałów).
1. Przygotowanie próbek
- Ekstrakcja białek
- Przenieść zatrzaskowo zamrożone próbki komórek lub tkanek z temperatury -80 °C na suchym lodzie, rozmrozić na lodzie i przemyć w razie potrzeby lodowatym roztworem soli fizjologicznej buforowanym 1x fosforanami (PBS). Unikaj niepotrzebnych cykli zamrażania i rozmrażania, ponieważ wpłynie to na jakość białka.
- Dodać bufor do testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA) (25 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% deoksycholan sodu, 0,1% SDS) zawierający 1x inhibitor proteazy do każdej próbki, stosując optymalną ilość na masę tkanki.
nuta: W zależności od zastosowania, rodzaj i ilość bufora homogenizacyjnego może wymagać dalszej optymalizacji.
- Do homogenizacji próbek tkanek należy użyć ręcznego homogenizatora elektrycznego z tłuczkiem polipropylenowym. Pomiędzy każdą próbką umyj tłuczek w wodzie podwójnie destylowanej i osusz go czystą chusteczką. Zmieniaj tłuczek między różnymi warunkami eksperymentalnymi i tkankami.
- Pozostawić próbki na lodzie na 10 minut po homogenizacji. Odwirować próbki w temperaturze >10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
- Przenieść supernatant do nowej probówki na lodzie, nie naruszając osadu. Supernatantem jest próbka białka. Przechowywać wyekstrahowane białko w temperaturze -80 °C lub bezpośrednio przystąpić do pomiaru stężenia białka.
- Kwantyfikacja i normalizacja stężenia białka
- Zmierz stężenie białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA). Przygotować mieszaninę do oznaczania BCA zgodnie z instrukcjami producenta w 96-dołkowej płytce optycznej, używając 200 μl mieszanki BCA na basenik.
nuta: Inne metody kwantyfikacji, takie jak testy Lowry'ego i Bradforda, mogą być również stosowane do określania stężenia białka, o ile stężenie białka jest konsekwentnie określane ilościowo we wszystkich eksperymentach.
- Przygotować wzorce albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w rosnących stężeniach w trzech egzemplarzach i dodać 1 μl każdej próbki białka w dwóch egzemplarzach. Inkubować 96-dołkową płytkę w podgrzanym bloku grzewczym w temperaturze 60 °C przez 10 minut lub dłużej, jeżeli przewiduje się, że stężenie białka będzie niskie.
- Po inkubacji zmierzyć absorpcję przy długości fali 560 nm za pomocą czytnika płytek.
- Eksportuj pomiary czytnika płytek i oblicz stężenie białka, porównując średnie wartości absorbancji każdej próbki z krzywą wzorcową uzyskaną przy użyciu wzorca białka. Wartość R-kwadrat dla krzywej wzorcowej powinna być większa lub równa 0,98, aby dokładnie oszacować stężenie białka w próbce.
- Normalizować ilość białka, przygotowując rozcieńczenia próbek białek w buforze próbki i wodzie ultraczystej. Całkowitą objętość można regulować w zależności od rodzaju użytego żelu. Zaleca się załadowanie 30 μg białka na linię jako ilość początkową. W razie potrzeby dodać środek redukujący, taki jak ditiotreitol (DTT; stężenie końcowe 5 mM) lub beta-merkaptoetanol (stężenie końcowe 200 mM) do każdej próbki. Odpipetować nierozcieńczony beta-merkaptoetanol w dygestorium.
- Próbki należy inkubować w bloku grzewczym w temperaturze 70 °C przez 10 minut. Próbki należy umieścić na lodzie, odwirować i krótko odwirować w celu zebrania. Trzymaj na lodzie do momentu załadowania żelu.
2. Elektroforeza żelowa próbek białek
- Konfiguracja urządzenia i żelu
- Ustawić prefabrykowany żel gradientowy Bis-Tris 4–12% (patrz tabela materiałów) w systemie komory do elektroforezy żelowej. Przed użyciem spłucz żele wodą podwójnie destylowaną.
UWAGA: W zależności od wielkości, interakcji i obfitości interesującego białka można stosować żele o różnym gradiencie, środku buforującym lub wielkości i liczbie studzienek.
- Dodaj 500 ml 1x buforu do biegania MES SDS rozcieńczonego w podwójnie destylowanej wodzie na zbiornik. Ostrożnie wyjmij grzebień z żeli po dodaniu bufora do biegania, nie naruszając dołków w żelu do układania.
- Ładowanie białka
- Załaduj 3,5 μl wzorca białka do studzienki. W zależności od układu próbki, załadowanie drabinki białkowej po obu stronach żelu może pomóc w dokładniejszym oszacowaniu wielkości białka. Użyj końcówek do ładowania żelu z cienką końcówką, aby uzyskać dokładniejsze ładowanie próbki.
- W przypadku stosowania wewnętrznego wzorca do normalizacji między błonami (patrz krok 5 poniżej i dyskusja), załaduj ilość równą innym próbkom do pierwszych 3 dołków obok drabinki białkowej.
- Załadować 30 μg każdej próbki do pozostałych studzienek. Dodaj 1x bufor próbki do wszystkich pustych studzienek.
- Elektroforezy
- Zmontuj zbiornik żelu po załadowaniu próbek. Przepuścić próbki przez żel do układania w stos pod napięciem 80 V przez 10 minut, a następnie pod napięciem 150 V przez dodatkowe 45-60 minut.
3. Transfer białka
UWAGA: Transfer białka w tym protokole odbywa się za pomocą dostępnego na rynku systemu półsuchego blottingu (patrz Tabela Materiałów) w celu uzyskania szybkich i spójnych wyników.
- Przygotuj transfer białka, wstępnie mocząc bibułę filtracyjną w wodzie podwójnie destylowanej i upewniając się, że nóż do żelu, plastikowa pipeta Pasteura, wałek do bibułki i kleszcze są gotowe do użycia.
- Otwórz stos transferowy, ostrożnie usuwając całą folię do pakowania. Zdejmij górę z dolnego stosu i odłóż go na bok. Szybko zwilż membranę na dolnym stosie kilkoma kroplami buforu do elektroforezy (2-3 ml). Po otwarciu stosu transferowego ważne jest, aby zapobiec wysychaniu membrany PVDF.
- Po zatrzymaniu elektroforezy otwórz wstępnie obrobiony żel za pomocą noża do żelu i odetnij żel do układania w stosy. Przetnij żel wokół jego krawędzi, aby uwolnić go od plastikowego odlewu. Nóż do żelu powinien być mokry, aby zapobiec uszkodzeniu żelu.
- Zmontuj stos transferowy od dołu do góry: dolny stos (zawierający membranę PVDF), żel białkowy i bibułę filtracyjną. Użyj wałka do bibuły, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza. Umieść górny stos na bibule filtracyjnej i ponownie zwiń stos, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Nie należy naciskać zbyt mocno, ponieważ może to spowodować odkształcenie żelu podczas przenoszenia białka.
- Przenieś cały stos do urządzenia transferowego za pomocą elektrody po lewej stronie urządzenia i umieść gąbkę żelową na wierzchu stosu tak, aby była wyrównana z odpowiednimi stykami elektrycznymi na urządzeniu. Zamknij pokrywę, wybierz i uruchom odpowiedni program (zalecanym punktem początkowym jest 20 V przez 7 minut).
- Po zakończeniu pozostaw pokrywę zamkniętą na 2 minuty, aby komin ostygł i zapobiec wysychaniu membrany. Usuń stos transferowy i przytnij membranę do rozmiaru żelu. Szybko umyj przeciętą membranę wodą podwójnie destylowaną, zanim przejdziesz do całkowitego barwienia białka.
4. Barwienie białka ogółem
UWAGA: Korzystanie z detekcji fluorescencyjnej daje znaczne korzyści w porównaniu z bardziej tradycyjnymi podejściami (np. wykrywaniem ECL), ponieważ zakres liniowy i czułość mogą być znacznie lepiej kontrolowane. Dlatego w krokach 4 i 5 stosuje się fluorescencyjny TPS i fluorescencyjne przeciwciała drugorzędowe (patrz tabela materiałów).
- Zwiń membranę do probówki o pojemności 50 ml stroną z białkiem skierowaną do wewnątrz. Ze względu na światłoczułość fluorescencyjnego TPS i przeciwciał drugorzędowych, wszystkie kolejne etapy są przeprowadzane w ciemności.
- Dodać 5 ml roztworu barwienia białkowego (patrz tabela materiałów) i inkubować na wałku przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ponieważ TPS i bufor płuczący zawierają metanol, należy wykonać te czynności w dygestorium.
- Wyrzucić roztwór barwiący i szybko przemyć dwukrotnie 5 ml roztworu myjącego (6,3% kwasu octowego w 30% metanolu). Umieść rurkę na krótko z powrotem na wałku między etapami mycia. Przed kontynuowaniem krótko spłucz membranę ultraczystą wodą.
5. Blokowanie, inkubacja przeciwciał i wykrywanie
- Blokowanie membrany: Dodać 3 ml buforu blokującego (patrz Tabela materiałów) do probówki o pojemności 50 ml zawierającej membranę. Inkubować błonę na wałku przez 30 minut w temperaturze pokojowej. W zależności od wyboru przeciwciała, rodzaj zastosowanego buforu blokującego może wymagać optymalizacji.
- Inkubacja przeciwciał pierwotnych
- Odrzuć bufor blokujący i zastąp go pierwszorzędowym przeciwciałem o odpowiednim, zoptymalizowanym stężeniu (Rysunek 1 i Rysunek 2: mysi anty-SMN, w stosunku 1:1 000, rozcieńczony w buforze blokującym).
nuta: Odpowiednia optymalizacja przeciwciał pierwszorzędowych powinna obejmować potwierdzenie, że przeciwciało wykrywa produkt białkowy o odpowiedniej wielkości, nie wykazując przy tym żadnego lub minimalne wiązanie z innymi, niespecyficznymi produktami białkowymi. Jeśli to możliwe, przetestuj i porównaj wiele przeciwciał przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania.
- Inkubować błonę na wałku przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia usuń roztwór przeciwciał i umyj go 6 razy przez 5 minut 1x PBS na wałku w temperaturze pokojowej (RT).
- Inkubacja przeciwciał wtórnych
- Przygotować swoiste przeciwciało drugorzędowe w stosunku 1:5 000 przeciwko gospodarzowi przeciwciała pierwszorzędowego w buforze blokującym o pojemności 5 ml. Inne przeciwciała drugorzędowe mogą wymagać innych rozcieńczeń lub użycia alternatywnych blokujących.
- Inkubować błonę z roztworem przeciwciał drugorzędowych na wałku przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji umyć membranę trzy razy po 30 minut 1x PBS na wałku.
- Wysuszyć membranę i chronić ją przed światłem za pomocą folii aluminiowej do momentu wykrycia. Membrany mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C w celu długotrwałego przechowywania.
- Akwizycja obrazu
- Zaloguj się do komputera podłączonego do skanera. Umieść membranę na skanerze stroną z białkiem skierowaną w dół i wybierz obszar skanowania w oprogramowaniu.
- Zoptymalizuj intensywność lasera dla obu kanałów (700 nm i 800 nm), upewniając się, że nie występuje nasycenie. Uzyskaj obrazy w obu kanałach i wyeksportuj je do dalszej analizy (krok 6).
6. Analiza i kwantyfikacja Western blot
UWAGA: Te zalecenia są oparte na darmo dostępnym oprogramowaniu Image Studio. Jednak porównywalne analizy można również przeprowadzić za pomocą innych pakietów oprogramowania, takich jak ImageJ.
- Zaimportuj plik: Utwórz lokalny obszar roboczy na komputerze używanym do analizy. W ten sposób generowana jest baza danych plików graficznych dla pozyskanych zachodnich plam. Zaimportuj pliki uzyskane na skanerze i wybierz obraz do analizy.
- Analiza TPS
- Wyświetl kanał 700 nm, aby pokazać całkowity wynik barwienia białka. Przykład obrazu TPS znajduje się na rysunku 1, w którym bezpośrednio porównuje się różne tkanki noworodków (P5) (ryc. 1A-B) i 10-tygodniowych myszy (ryc. 1C-D). Podobnie, rycina 2 pokazuje przykład bezpośredniego porównania tkanki mózgowej myszy w różnym wieku.
- Wybierz kartę Analiza w prawym górnym rogu i wybierz opcję Dodaj prostokąt, aby zdefiniować obszar zainteresowania do normalizacji (Rysunek 1B, D). Skopiuj i wklej pierwszy obszar prostokąta do każdej pojedynczej próbki, aby upewnić się, że zdefiniowany obszar ma ten sam rozmiar dla wszystkich analizowanych pasów.
- Skopiuj wynik z zakładki Kształty w lewym dolnym rogu oprogramowania.
- Kwantyfikacja
nuta: Optymalne podejście do ilościowego oznaczania próbek zależy od projektu eksperymentalnego. Przedstawimy tutaj ilustracyjny przykład wykrywania białka neuronu ruchowego przeżycia (Smn; kluczowe białko zaangażowane w chorobę nerwowo-mięśniową rdzeniowego zaniku mięśni), o którym wiadomo, że zmniejsza się z czasem, oraz jak normalizacja intensywności sygnału Smn do TPS zapewnia wiarygodne szacunki rozwoju ekspresji białka.
- Rycina 2 pokazuje spadek ekspresji Smn wraz ze wzrostem wieku zwierzęcia z TPS jako kontrolą obciążenia białka. Powtórz kroki 6.2.1-6.2.3, aby określić ilościowo obciążenie białkami (rysunek 2B). Powtórz kroki 6.2.1-6.2.3 w kanale 800 nm (rysunek 2A), aby przeanalizować interesujące białko.
- Skopiuj wyniki zarówno z TPS, jak i białka będącego przedmiotem zainteresowania do programu arkusza kalkulacyjnego. W arkuszu kalkulacyjnym najpierw znormalizuj obciążenie białkami, określając najwyższy sygnał TPS i dzieląc każdą wartość sygnału TPS przez tę wartość, aby uzyskać znormalizowaną wartość obciążenia białka.
- Podziel wartość sygnału 800 nm z każdej pojedynczej próbki przez odpowiadającą jej znormalizowaną wartość białka, aby obliczyć względny stosunek ekspresji białka w różnych próbkach.
- Po pierwszej normalizacji porównaj różne punkty czasowe lub tkanki ze średnią wartością wzorca wewnętrznego, aby umożliwić bezpośrednie porównania między różnymi błonami i eksperymentami.
