Western blotting pojedynczych komórek w celu określenia heterogeniczności komórek

Streszczenie

Źródło: Wang, L., et al., Kwantyfikacja aktywności chemotaktycznej monocytów in vivo i charakterystyka makrofagów pochodzących z monocytów krwi. J. Vis. Exp. (2019).

Film opisuje technikę western blottingu jednokomórkowego, która identyfikuje skład pojedynczych komórek uchwyconych na jednokomórkowym chipie western blotting w heterogenicznej zawiesinie. Technika ta wykrywa intensywność fluorescencji fluoroforu przypisanego do markera białkowego specyficznego dla komórki docelowej.

Protokół

1. Określanie składu komórek w zawiesinie komórek za pomocą analizy pojedynczej komórki Western Blot (scWB)

1. Przed użyciem należy ponownie nawodnić chip scWB w 15 ml 1x buforu zawiesiny na szalce Petriego przez co najmniej 10 minut w temperaturze pokojowej.
2. Dodaj 1 ml rozcieńczonej zawiesiny jednokomórkowej (10 000-100 000 komórek/ml) do uwodnionego chipa. Ułóż powierzchnię na dnie szalki Petriego o średnicy 10 cm. Upewnij się, że powierzchnia jest płaska.
3. Przykryj szalkę Petriego pokrywką, aby zapobiec wysuszeniu i pozwól komórkom osiąść przez 5-15 minut według gradientu.
4. Umieść chip pod mikroskopem jasnego pola i sprawdź studzienki w 10-krotnym powiększeniu.
   nuta: Około 15-20% mikrostudzienek powinno być zajętych przez pojedynczą komórkę, a mniej niż 2% studzienek powinno zawierać 2 lub więcej komórek.
5. Przechylić 10-centymetrową szalkę Petriego zawierającą wiór o 45 stopni.
6. Umyj chip za pomocą bufora zawiesinowego 1x, aby usunąć nieprzechwycone komórki z powierzchni chipa poprzez delikatne pipetowanie od góry do dołu chipa. Powtórz 3 razy.
7. Przygotuj jednokomórkowy instrument zachodni.
8. Ustaw czas lizy, czas elektroforezy i czas przechwytywania UV. Aby przeanalizować rekrutowane makrofagi odzyskane z czopa żelowego pochodzącego z błony podstawnej, użyj następujących ustawień: czas lizy: 0 s; czas elektroforezy: 160 s; Czas przechwytywania UV 240 s.
9. Ostrożnie załaduj chip do ogniwa elektroforetycznego jednoogniwowego zachodniego instrumentu, skierowanego w stronę żelu. Zachowaj ostrożność, aby nie uszkodzić żelowej strony chipa.
10. Wlej bufor do lizy/pracy do komory i całkowicie przykryj cały jednokomórkowy chip zachodni. Rozpocznij lizę komórek.
11. Uruchom instrument scWB przy użyciu ustawienia wymienionego w 1.8.
12. Po zakończeniu cyklu przenieś wiór na 10-centymetrową szalkę Petriego i umyj wiór dwukrotnie za pomocą 1x bufora myjącego przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
13. Przygotować rozcieńczenia przeciwciała pierwszorzędowego (anty-winkulina: 1:10; anty-CD45: 1:15, anty-CD11b: 1:20, anty-F4/80: 1:10) w całkowitej objętości 80 μl rozcieńczalnika przeciwciała (zmieszać 8 μl przeciwciała 1 plus 8 μl przeciwciała 2 plus 64 μl rozcieńczalnika).
14. Dodać 80 μl roztworu przeciwciała pierwotnego do komory sondowania przeciwciał i opuścić chip żelową stroną do dołu, tak aby roztwór przeciwciała przeniknął przez chip.
15. Inkubować z roztworem przeciwciała pierwszorzędowego przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
16. Umyj frytki trzy razy przez 10 minut w 1x buforze myjącym na shakerze.
17. Umyj frytki raz przez 10 minut w wodzie na shakerze, aby odsolić żel.
18. Przygotować rozcieńczenie 1:20 przeciwciała drugorzędowego o całkowitej objętości 80 μl (zmieszać 2 μl przeciwciała drugorzędowego plus 78 μl rozcieńczalnika).
19. Inkubować chip z przeciwciałem drugorzędowym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, chroniony przed światłem.
20. Umyj frytki trzy razy przez 10 minut z 1x buforem myjącym na shakerze.
21. Zakręć wiórem za pomocą suwaka, aby usunąć pozostały bufor myjący.
22. Zeskanuj chip na dwulaserowym skanerze mikromatrycowym z rozdzielczością 5 μm w kanale widmowym fluoroforu sprzężonego z przeciwciałami drugorzędowymi.
23. Analizuj dane za pomocą oprogramowania specyficznego dla scWB.

2. Zdejmowanie chipa scWB

1. Przechowuj zeskanowany chip w buforze do mycia, aż będzie gotowy do rozebrania.
2. Umieść łaźnię wodną w dygestorium.
3. Umieść stojak na probówki o pojemności 50 ml w łaźni wodnej z wodą znajdującą się zaledwie 1 cm nad stojakiem i ustaw temperaturę wody na 60 °C.
4. Przygotować bufor do usuwania odpędów. Na 1 l roztworu buforowego do oddzielania rozpuścić 9,85 g Tris-HCl (pH 6,8) i 20 g SDS w 900 ml wody destylowanej i dostosować pH. Następnie napełnij wodą destylowaną do 1L. Dodaj 0,8% (v/v) β-merkaptoetanolu (β-ME; 14,3 M) bezpośrednio przed każdym użyciem.
5. Po wstępnym skanowaniu umieść chip na 10-centymetrowej szalce Petriego przed usunięciem izolacji.
6. Na każdy chip weź 40 ml buforu do oddzielania i dodaj 320 μl β-ME.
   UWAGA: β-ME jest toksyczny i niebezpieczny dla ludzi i środowiska. Poniższą procedurę należy wykonać w dygestorium.
7. Umieść chip w kanistrze i uszczelnij kanister parafilmem, aby zapobiec przedostawaniu się wody do kanistra
8. Umieść kanister w stojaku na probówki we wstępnie podgrzanej łaźni wodnej.
9. Inkubować przez 90 minut.
10. Ostrożnie wyjmij wiór z kanistra i umieść go na świeżej szalce Petriego.
11. Krótko umyj frytki raz za pomocą 1x bufora do mycia. Następnie dodaj 15 ml 1x buforu myjącego do szalki Petriego.
12. Myj frytki przez 15 minut na shakerze. Powtórz krok prania cztery razy.
    nuta: Chip jest gotowy na następne przeciwciało pierwszorzędowe (patrz kroki 1.12 - 1.21)

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szalka Petriego 10 cm	Griner Bio-ONE	tel. 664 160
10x zderzak zawieszenia	BiałkoProsty	Czynnik R101
Szalka Petriego 15 cm	sokół	353025
2-merkaptoetanol	MP BIOMEDYCYNA	2194705
5% bufor do mycia	BiałkoProsty	Czynnik R252
Rozcieńczalnik przeciwciał	BiałkoProsty	Numer katalogowy: 042-203
Wirówka stołowa	Beckman Coulter		Wirówka Microfuge 22R
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich	A7906-100G
Calceina AM	Rybak termiczny	Zobacz materiał C3099	1 ml
Płyta CD11b	Novus Biologicals	NB110-89474
CD45 (D4H7K) mAb królika	Technologie sygnalizacji komórkowej	727987S
CD68/SR-D1 (FA-11)	Novus Biologicals	NBP2-33337SS
Wizja wiolometru	Nexcelom
Rozpuść	Bd	354235	100 ml
Nożyczki preparacyjne
Przeciwciało drugorzędowe anty-króliczej IgG osła [NL557]	Novus Biologicals	NL004	Koniugat NL 557
Przeciwciało drugorzędowe anty-Rat IgG (H+L) osła [DyLight 650]	Novus Biologicals	NBP1-75655	Koniugat DyLight 650
F4/80 (CI-A3-1)	Novus Biologicals	NB600-404SS
Blok grzewczy	Dzielnica Effendorf	Numer katalogowy: 22331	Mieszalnik termiczny
Bufor do lizy/pracy	BiałkoProsty	Czynnik chłodniczy R200
Matrigel Matrix (Zmniejszony współczynnik wzrostu)	Bd	Numer telefonu 354230	Pojemność 10 ml
Skaner mikromacierzy	PerkinElmer powiedział:	ScanArray Gx
Probówka do mikrowirówek	Fisher Naukowy	05-408-129
mikroskop	Rybak termiczny	Evos fl
Milo	BiałkoProsty		Jednokomórkowy western
igła	Bd	305111	26 gramów
Parafilm
Komora pomiarowa	BiałkoProsty	Numer katalogowy: 035-020
Rekombinowane mysie białko CCL2/JE/MCP-1	Prace badawczo-rozwojowe	479-JE-050
Układ scalony scWEST	BiałkoProsty	Zobacz materiał C300
Shakerze bostońskim	Ekspres biologiczny		Wytrząsarka orbitalna Gene mate
Jednoogniwowy zachodni pojemnik na wióry	BiałkoProsty	Numer katalogowy: 035-118
Suwak	Labnet	Zobacz materiał C1303-T
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP 166-500
strzykawka	Bd	309602	1 ml
Chlorowodorek trisu	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP 153-500
Pęseta	BiałkoProsty	Numer katalogowy: 035-020
Kąpiel wodna	Rybak termiczny

powiedział: powiedział: