Chemiluminescencyjny test Western Blot do przetwarzania białek

Streszczenie

Źródło: Hillert-Richter, L. K. et al., Pomiar składu kompleksu sygnalizacyjnego CD95 powodującego śmierć i przetwarzanie prokaspazy-8 w tym kompleksie. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film opisuje oparte na chemiluminescencji western blot immunoprecypitowanych lizatów. Technika ta pomaga określić przetwarzanie i aktywację białek. Wykryty sygnał chemiluminescencyjny jest proporcjonalny do poziomu przetworzenia białka podczas jego aktywacji.

Protokół

Eksperymenty z komórkami T zostały przeprowadzone zgodnie z umową etyczną 42502-2-1273 Uni MD.

1. Przygotowanie komórek do eksperymentu

UWAGA: Średnia liczba komórek dla tej immunoprecypitacji wynosi 1 × 10⁷. Komórki przylegające muszą zostać wysiane na jeden dzień przed eksperymentem, tak aby w dniu eksperymentu było 1 ×^{10 7} komórek.

1. Przygotowanie komórek adherentnych do eksperymentu
   1. Wysiew 5-8 × 10⁶ przylegających komórek w 20 ml pożywki (patrz tabela materiałów dla składu) dla każdego warunku w 14,5 cm szalkach na dzień przed rozpoczęciem eksperymentu.
   2. W dniu eksperymentu upewnij się, że komórki zlewają się w 80-90% i przylegają do naczynia. Wyrzuć pożywkę i dodaj świeżą pożywkę do przylegających komórek.
2. Przygotowanie komórek zawiesinowych do eksperymentu
   1. Ostrożnie umieść 1 × 10⁷ komórek zawiesinowych w 10 ml pożywki hodowlanej (patrz tabela materiałów dla składu) na warunki w 14,5 cm szalkach bezpośrednio przed rozpoczęciem eksperymentu.
   2. Jeśli używasz komórek pierwotnych, wyizoluj pierwotne limfocyty T zgodnie z wcześniej opisaną procedurą. Traktuj pierwotne limfocyty T 1 μg / ml fitohemaglutyniny przez 24 godziny, a następnie 25 U / ml IL2 przez 6 dni.
   3. Ostrożnie umieścić 1 × 10⁸ pierwszorzędowych limfocytów T w 10 ml pożywki hodowlanej (patrz Tabela materiałów dla składu) w każdym stanie na 14,5 cm szalkach bezpośrednio przed rozpoczęciem eksperymentu.
      nuta: Ta większa liczba pierwotnych limfocytów T jest zalecana, ponieważ komórki te są mniejsze.

2. Stymulacja CD95L

1. Stymuluj komórki za pomocą CD95L (wyprodukowanego zgodnie z wcześniejszym opisem lub dostępnego na rynku (patrz Tabela Materiałów).
   nuta: Stężenie CD95L i czas stymulacji są zależne od typu komórki. Przygotuj jeden warunek stymulacji dwukrotnie, aby równolegle wygenerować próbkę "kontroli kulek".
   1. Stymuluj przylegające komórki wybranym stężeniem CD95L. Trzymać płytkę pod kątem i odpipetować ligand do pożywki, nie dotykając przylegających komórek.
   2. Stymuluj komórki zawiesinowe za pomocą CD95L, pipetując roztwór liganda do zawiesiny komórki.

3. Pobieranie i liza komórek

1. Umieść naczynia komórkowe na lodzie.
   nuta: Nie wyrzucaj nośnika. Umierające komórki unoszą się w pożywce i są ważne dla analizy.
2. Dodać 10 ml zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do zawiesiny komórek i zeskrobać przyłączone komórki z płytki. Zebrać zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 50 ml.
3. Umyj naczynie z komórkami dwukrotnie 10 ml zimnego PBS i umieść roztwór myjący w tej samej probówce o pojemności 50 ml. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 500 × g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C.
4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 1 ml zimnego PBS. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 1,5 ml.
5. Odwirować zawiesinę komórek o stężeniu 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml zimnego PBS.
6. Odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze 500 × g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 1 ml buforu do lizy (zawierającego 4% koktajlu inhibitorów proteazy). Inkubuj go przez 30 minut na lodzie.
7. Odwirować lizat z maksymalną prędkością (~17 000 × g) przez 15 minut, 4 °C.
8. Przenieść supernatant (lizat) do czystej probówki. Wyrzuć granulkę. Weź 50 μl lizatu do innej probówki. Przeanalizować stężenie białka za pomocą testu Bradforda i pobrać ilość lizatu odpowiadającą 25 μg białka w fiolce. Dodać bufor ładujący (patrz Tabela Materiałów dla składu) do fiolki. Przechowywać w temperaturze -20 °C jako kontrolę lizatu.

4. Immunoprecypitacja (IP)

1. Do lizatu dodać 2 μl przeciwciał anty-APO-1 i 10 μl kulek sefarozy białka A (przygotowanych zgodnie z zaleceniami producenta). Dodać tylko 10 μl kulek do oddzielnej probówki zawierającej lizat (próbka stymulowana), aby wytworzyć "kontrolę kulek".
   nuta: Używaj końcówek do pipet z szerokimi otworami, przecinając końcówki lub kupując specjalne końcówki do IP podczas obchodzenia się z kulkami sefarozy białkowej A.
2. Inkubować mieszaninę lizatu z przeciwciałami/kulkami sefarozy białka A, delikatnie mieszając przez noc w temperaturze 4 °C. Odwirować lizaty z przeciwciałami/białkiem A sefaroza w skulkach 500 × g przez 4 minuty, 4 °C. Odrzucić supernatant, dodać 1 ml zimnego PBS do kulek i powtórzyć ten etap co najmniej trzy razy.
3. Odrzucić supernatant. Zassać kulki, najlepiej za pomocą strzykawki Hamiltona o pojemności 50 μl.

5. Western blot

1. Dodać 20 μl 4x buforu ładującego (patrz Tabela Materiałów dla składu) do kulek i podgrzewać w temperaturze 95 °C przez 10 min. Podgrzewać kontrole lizatu w temperaturze 95 °C przez 5 min.
2. Załaduj lizaty, IP i wzorzec białka do 12,5% żelu z dodecylosiarczanu sodu (SDS) (patrz Tabela materiałów dla preparatu żelu) i pracuj ze stałym napięciem 80 V.
3. Przenieść białka z żelu SDS do membrany nitrocelulozowej.
   nuta: W tym przypadku zastosowano technikę półsuchą, zoptymalizowaną pod kątem interesujących białek, do transferu w ciągu 12 minut (25 V; 2,5 A = stała). Namocz membranę nitrocelulozową i dwa mini-size stosy transferowe w buforze do elektroforezy (patrz Tabela materiałów dla składu, przygotuj zgodnie z instrukcjami producenta) na kilka minut przed western blot.
4. Umieść osuszoną błonę w pudełku i zablokuj ją na 1 godzinę w roztworze blokującym (0,1% Tween-20 w PBS (PBST) + 5% mleka). Inkubować błonę z roztworem blokującym pod delikatnym mieszaniem.
5. Umyj membranę trzykrotnie PBST przez 5 minut przy każdym praniu.

6. Wykrywanie Western blot

1. Dodać pierwsze przeciwciało pierwszorzędowe we wskazanym rozcieńczeniu (patrz tabela materiałów) do błony i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie mieszając.
2. Umyj membranę trzykrotnie PBST przez 5 minut przy każdym praniu.
3. Inkubować błonę z 20 ml przeciwciała drugorzędowego (rozcieńczonego w stosunku 1:10 000 w PBST + 5% mleka) delikatnie wstrząsając przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
4. Umyj membranę trzykrotnie PBST przez 5 minut przy każdym praniu.
5. Odrzucić PBST i dodać około 1 ml substratu peroksydazy chrzanowej do membrany.
6. Wykryć sygnał chemiluminescencyjny (patrz Tabela materiałów).
   nuta: Czas ekspozycji i liczba przechwyconych obrazów zależą od ilości białka w komórce i swoistości zastosowanych przeciwciał. Należy ją ustalić empirycznie dla każdego przeciwciała użytego do wykrywania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
12,5% SDS żel	Wykonane samodzielnie		Na dwa żele separacyjne: 3,28 ml destylowany H2O 2,5 ml Tris; pH 8,8; 1,5 M 4,06 ml akryloamid 100 μL 10% SDS 100 μL 10% APS 7,5 μL TEMED dla dwóch żeli zbiorczych: 3,1 ml destylowany H2O 1,25 ml Tris; pH 6,8; 1,5 M 0,5 ml akryloamid 50 μL 10% SDS 25 μL 10% APS 7,5 μL TEMED
Naczynia komórkowe 14,5 cm	Greiner	Numer katalogowy: 639160
Akrylamid	Carla Rotha	Certyfikat A124.1
Końcówki pipet z filtrem aerozolowym z filtrem o wysokiej odzysku i szerokim otworem	Firma VWR	46620-664 (Ameryka Północna) lub 732-0559 (Europa)	Służy do pipetowania kulek do lizatu
Służy do pipetowania kulek do lizatu	Sigma Aldrich	Certyfikat A2103	Rozcieńczenie: 1:4000 w PBST + 1:100 NaN3
anty-APO-1 Ab	Dostarczone w tych eksperymentach przez prof. P. Krammera lub mogą być zakupione przez ENZO	ALX-805-038-C100	Stosowany tylko do immunoprecypitacji
anty-kaspaza-10 Ab	Biozol	MBL-M059-3	Rozcieńczenie: 1:1000 w PBST + 1:100 NaN3
anty-kaspaza-3 Ab	Sygnalizacja komórkowa	9662 S	Rozcieńczenie: 1:2000 w PBST + 1:100 NaN3
anty-kaspaza-8 Ab C15	Dostarczone w tych eksperymentach przez prof. P. Krammera lub mogą być zakupione przez ENZO	ALX-804-242-C100	Rozcieńczenie: 1:20 w PBST + 1:100 NaN3
anty-CD95 Ab	Santa Cruz	SC-715	Rozcieńczenie: 1:2000 w PBST + 1:100 NaN3
anty-c-FLIP NF6 Ab	Dostarczone w tych eksperymentach przez prof. P. Krammera lub mogą być zakupione przez ENZO	ALX-804-961-0100	Rozcieńczenie: 1:10 w PBST + 1:100 NaN3
anty-FADD 1C4 Ab	Dostarczone w tych eksperymentach przez prof. P. Krammera lub mogą być zakupione przez ENZO	ADI-AAM-212-E	Rozcieńczenie: 1:10 w PBST + 1:100 NaN3
anty-PARP Ab	Sygnalizacja komórkowa	Numer katalogowy: 9542	Rozcieńczenie: 1:1000 w PBST + 1:100 NaN3
Aps	Carla Rotha	9592.3
β-merkaptoetanol	Carla Rotha	4227.2
Roztwór Bradford Test białkowy Koncentrat odczynnika barwnikowego 450ml	Bio Rad	500-0006	Używany zgodnie z instrukcjami producenta
CD95L	Dostarczone w tych eksperymentach przez prof. P. Krammera lub mogą być zakupione przez ENZO	ALX-522-020-C005
Detektor chemiluminescencji Chem Doc XRS+	Bio Rad
Kompletny koktajl inhibitorów proteazy ()	Sigma Aldrich	ALX-522-020-C005	Przygotowany zgodnie z instrukcjami producenta
DPBS (10x) bez Ca, Mg	PAN Biotechnologiczny	P04-53500	Rozcieńczenie 1:10 z H2O, przechowywanie w lodówce
Bufor do elektroforezy	Wykonane samodzielnie		10x bufor do elektroforezy: 60,6 g Tris 288 g glicyny 20 g SDS i 2 L H2O rozcieńczenie 1:10 przed użyciem
glicyna	Carla Rotha	3908.3
Kozia Anty-Mysia IgG1 HRP	Południowa Biotechnologia	Numer katalogowy 1070-05	Rozcieńczenie 1:10.000 w PBST + 5% mleka
Kozia anty-mysia IgG2b HRP	Południowa Biotechnologia	Numer katalogowy 1090-05	Rozcieńczenie 1:10.000 w PBST + 5% mleka
Kozia anty-królicza IgG-HRP	Południowa Biotechnologia	Numer katalogowy 4030-05	Rozcieńczenie 1:10.000 w PBST + 5% mleka
Interleukina-2 Człowiek (hIL-2)	Merckgroup/ Roche	11011456001	Do aktywacji limfocytów T
Kcl	Carla Rotha	Numer katalogowy 6781.2
KH2PO4	Carla Rotha	3904.1
Bufor ładujący 4x Laemmli Sample Buffer, 10 ml	Bio Rad	Numer katalogowy: 161-0747	Przygotowany zgodnie z instrukcjami producenta
Podłoże Luminata Forte Western HRP	Milipory	WBLUFO500
Bufor do lizy	Wykonane samodzielnie		13,3 ml Tris-HCl; pH 7,4; 1,5 M 27,5 ml NaCl; 5 M 10 ml EDTA; 2 mM 100 ml Triton X-100 dodać 960 ml H2O
Pożywka dla komórek adherentnych DMEM F12 (1:1) w stabilnej glutaminy, 2,438 g/L	PAN Biotechnologiczny	P04-41154	Dodanie 10% FCS, 1% penicyliny-streptomycyny i 0,0001% puromycyny do podłoża
Pożywka dla pierwotnych limfocytów T	gibco od Life Technologie	21875034	Dodanie do pożywki 10% FCS i 1% penicyliny-streptomycyny
Mleko w proszku	Carla Rotha	Zobacz materiał T145.4
Na2HPO4	Carla Rotha	Zobacz materiał P030.3
Zawartość NaCl	Carla Rotha	3957.2
Biblioteka PBST (PBST	Wykonane samodzielnie		20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56,8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 Copyright © 2021 JoVE Journal of Visualized Experiments jove.com Strona 3 z 3 20 mL Tween-20 i 2 L H2O rozcieńczenie 1:20 przed użyciem
PBST + 5% mleka	Wykonane samodzielnie		50 g mleka w proszku + 1 L PBST
Pha	Thermo Fisher Naukowy	R30852801	Do aktywacji limfocytów T
Pakiet Power Pac HC	Bio Rad
Precision Plus Protein Standard All Blue	Bio Rad	Numer katalogowy: 161-0373	Stosować od 3 do 5 μl
Białko A Sefaroza CL-4B koraliki	Novodirect/ Th.Geyer	GE 17-0780-01	Koraliki z żywicy Affinity przygotowane zgodnie z instrukcjami producenta
skrobaczka	Firma VWR	tel. 734-2602
Sds	Carla Rotha	4360.2
Shakerze bostońskim	Heidolph
Azydek sodu	Carla Rotha	Zobacz materiał K305.1
TEMED	Carla Rotha	2367.3
Stosy transferowe Trans Blot Turbo w rozmiarze mini	Bio Rad	Numer katalogowy: 170-4270	Używany zgodnie z instrukcjami producenta
Bufor transferowy TransBlot Turbo 5x	Bio Rad	10026938	Przygotowany zgodnie z instrukcjami producenta
TransBlot Turbo Membrana niktrocelulozowa w rozmiarze mini	Bio Rad	Numer katalogowy: 170-4270	Używany zgodnie z instrukcjami producenta
Trans-Blot-Turbo	Bio Rad
Tris	Substancja rozpuszczona Chem	8 08 51 000
Tryton X-100	Carla Rotha	3051.4
Tween-20 (Kanał Telewizyjny)	Pan Reac Appli Chem	A4974,1000

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: osób