Northern Blot do wykrywania i ilościowego oznaczania specyficznego mikroRNA w całkowitym ekstrakcie RNA tkanki roślinnej

Streszczenie

Źródło: Tirumalai, V., et al. RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs. J. Vis. Exp. (2020)

W tym filmie demonstrujemy northern blot, technikę hybrydyzacji do wykrywania i ilościowego oznaczania mikroRNA (miRNA) z całkowitego RNA wyekstrahowanego z tkanki roślinnej.

Protokół

1. Elektroforeza żelowa

1. Zatrzymaj bieg wstępny i umyj studzienki przed załadowaniem próbki.
2. Podgrzewać próbki w temperaturze 98 °C przez 1 minutę i ładować gorące próbki do studzienki za pomocą końcówek kapilarnych. Włóż końcówkę na dno studzienki tak, aby próbka zajmowała jedną cienką warstwę w studzience.
3. Pełne załadowanie wszystkich próbek. Uwzględnij ładowanie znacznika dekady RNA.
4. Uruchom żel pod napięciem 80 V, aż niebieski barwnik bromofenolowy zniknie prawie całkowicie. Błękit bromofenolowy działa w temperaturze 10 pz w 15% denaturującym żelu akrylowym.

2. Przygotowanie do elektro-blottingu

1. Przytnij membranę N+nylon do wymiarów szklanej płyty i oznacz membranę w prawym górnym rogu ołówkiem HB.
2. Delikatnie umieść membranę na powierzchni sterylnej wody, kierując się oznaczoną stroną w kierunku powierzchni wody. Namocz membranę przez 15 minut.
3. Wytnij 4 kawałki bibuły I na wymiary podkładki z włókna.
4. Przygotuj kanapkę z żelem, kładąc szarą stronę kasety w dół na czystej tacy.
5. Wstępnie zwilż podkładkę z włókna i umieść ją na kasecie. Usuń pęcherzyki powietrza.
6. Wstępnie zwilż jeden kawałek bibuły w 1x TBE i umieść go na podkładce z włókna. Usuń pęcherzyki powietrza, tocząc plastikową pipetę po papierze. Połóż kolejny kawałek wstępnie zwilżonej bibuły i usuń pęcherzyki powietrza.
7. Ostrożnie wyjmij żel z kasety biegowej i umieść go na zestawie kanapkowym, tak aby pierwsza załadowana próbka RNA znajdowała się w prawo.
8. Delikatnie zanurz wstępnie nasączoną membranę w 1x TBE i umieść ją na żelu, stroną skierowaną do oznaczonej strony w dół. Rozwałkuj, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
9. Zanurz kawałek bibuły, połóż go na membranie i usuń pęcherzyki powietrza. Zanurz kolejny kawałek bibuły, połóż go na kanapce i usuń pęcherzyki powietrza.
10. Uzupełnij kanapkę, umieszczając wstępnie zwilżoną podkładkę z włókna na zestawie i mocno zamykając kasetę.
11. Umieść kasetę transblot w module i napełnij 1x TBE, pH 8,2, aż do kreski bibuły.
12. Przelew przy napięciu 10 V, przez noc w temperaturze 4 °C.
13. Po przeniesieniu umieść wilgotną membranę na arkuszu papieru i natychmiast usieciuj RNA z membraną poprzez naświetlanie światłem UV o długości 254 nm (120 000 μdżuli/cm²). Usieciowana plama może być przechowywana w temperaturze 4 °C w celu dalszej hybrydyzacji.

3. Przygotowanie sondy znakowanej radioaktywnie

1. Zaprojektuj sondę, która jest całkowicie komplementarna w stosunku do małego RNA, które ma być wykryte.
2. Oznacz końcówkę sondy za pomocą ƳP32ATP (uzyskanego z BRIT) na jej końcu 5', łącząc składniki zgodnie z recepturą podaną w Tabeli 1.
3. Inkubować powyższą mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
4. Oddziel nieoznakowany ƳP32ATP od sondy za pomocą kolumny Sephadex G-25 zgodnie z protokołem producenta.

4.Hybrydyzacja plamy

1. Umieść skrzyżowaną usieciowaną plamę, stroną RNA skierowaną do góry, w butelce do hybrydyzacji.
2. Energicznie wymieszać ultraczuły bufor do hybrydyzacji, dodać 10 ml i inkubować blot w piecu do hybrydyzacji utrzymywanym w temperaturze 35 °C, z rotacją.
3. Wykonaj wstępną hybrydyzację przez 20 minut.
4. Wyjmij butelkę z piekarnika i delikatnie dodaj opisaną sondę do buforu hybrydyzacyjnego.
5. Hybrydyzować blot w temperaturze 35 °C, obracając się przez 12 godzin.
6. Po hybrydyzacji ostrożnie przenieść roztwór hybrydyzacyjny do probówki o pojemności 15 ml. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu ponownego użycia.
7. Wykonaj szybkie płukanie blot przez 2 minuty, aby usunąć nadmiar roztworu hybrydyzacyjnego, dodając 2x bufor SSC plus 0,5% SDS. Wyrzuć roztwór.
8. Inkubować blot z 2x buforem SSC plus 0,5% SDS przez 35 °C, z rotacją przez 30 min.
9. Ponownie przemyć blot 0,5x buforem SSC plus 0,5% SDS przez 35°C, obracając się przez 30 min.
10. Umieść plamę w pokrywie hybrydyzacyjnej, usuń nadmiar buforu i zapieczętuj go.
11. Wystaw go na noc na ekran kamery z luminoforem wolnym od promieniowania w kasecie.
12. Wykryj sygnał hybrydyzacji za pomocą obrazowania biomolekularnego i przeanalizuj wyniki za pomocą odpowiedniego oprogramowania.

Tabela 1: Tabela przepisów

Bufor i roztwór	przepis	Komentarze
10 X TBE	Bufor Tris 0,89 mln	pH powinno być ustawione na 8,2 za pomocą kwasu octowego
	0,89 M Kwas borowy
	30 mM EDTA
Mieszanka żelowa	15% akrylamid-bisakryloamid zol, 19:1	Mieszanka żelowa nie powinna zawierać kryształów mocznika
	Mocznik 8M
	1X TBE
Barwnik w żelu	0,05 %(m/v) błękit bromofenolowy	Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z dejonizowanym formamidem
	0,05 %(w/v) ksylen xyanol
	100 % dejonizowany - formamid
Etykietowanie sondy	Bufor PNK (10X, 2 μL)	Ta mieszanina zawiera cząsteczki radioaktywne, ten krok musi być wykonany przez przeszkolony personel w laboratorium radioaktywnym.
	Enzym PNK (1 μL)
	Oligo (100 μM, 0,1 μL)
	ƳP32 ATP (4 μL)
Bufor mycia - I	2X SSC
	0,5% (w/v) SDS
Bufor mycia - II	0,5 raza SSC
	0,5% (w/v) SDS
Bufor do usuwania powłok - I	0,5 raza SSC
	0,1% (w/v) SDS
Bufor do usuwania powłok - II	0,1 raza SSC
	0,1% (w/v) SDS

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
40% roztwór akrylamidu i bisakryloamidu	Sigma	Nr kat. A9926	chemiczny
Nadsiarczan amonu (APS)	Przedsiębiorstwo BioRad	Numer katalogowy: 1610700	chemiczny
bibuła	Bibuła Whatman I	1001-125	Test
Błękit bromofenolowy	Sigma	B5525-5G	chemiczny
Wskazówki dotyczące ładowania kapilarycznego	Przedsiębiorstwo BioRad	2239915	Wyroby z tworzyw sztucznych
Zdejonizowany formamid	Ambion	Zobacz materiał AM9342	chemiczny
Blok grzewczy	Eppendorf	Numer katalogowy 5350	urządzenie
Membrana Hybond N + nylon	Ge	RPN203B	Test
Butelka do hybrydyzacji	Sigma	Z374792-1EA	Wyroby z tworzyw sztucznych
Piec do hybrydyzacji	Thermo Scientific	1211V79	urządzenie
N,N,N',N'- Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)	Sigma	T7024-25ml	chemiczny
PhosphorImager)	GE- Skaner tajfunów	29187194	urządzenie
Ekran i kaseta PhosphorImager	GE Opieka zdrowotna	Przekaźniki GE28-9564-75	urządzenie
Pipety	Gilson, modele: P20 i P10	FA10002M, FA10003M	Wyroby z tworzyw sztucznych
Pipeta plastikowa	sokół	Numer telefonu 357550	Wyroby z tworzyw sztucznych
Aparatura do żelu poliakrylamidowego	Przedsiębiorstwo BioRad	1658003EDU	urządzenie
Kolumna Sephadex G-25	GE Opieka zdrowotna	27532501	urządzenie
Koncentrator Speed Vac	Thermo Scientific	20-548-130	urządzenie
Spinwin (Spinwin)	Tarsonowie	Numer katalogowy 1010	urządzenie
Kinaza polinukleotydowa T4 (PNK)	Neb	Zobacz materiał M0201S	Test
Aparat do transblot	Przedsiębiorstwo BioRad	1703946	urządzenie
Bufor hybrydyzacyjny ULTRAHyb	Ambion	Zobacz materiał AM8670	Test
mocznik	Fischer Naukowy	Numer katalogowy: 15985	chemiczny
Środek sieciujący UV	Promieniowanie UVP	CL-1000L	urządzenie
wir	Tarsonowie	Numer katalogowy 3020	urządzenie
Kąpiel wodna	NEOLAB (Laboratorium Neolab	D-8810	urządzenie
Cyjanol ksylenu	Sigma	Zobacz materiał X4126-10G	Test

powiedział: powiedział: Imager fosforowy ( TGL ) powiedział: