$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
UWAGA: Rekombinowane białka użyte w tym badaniu, Hsp90 i Cdc37, zostały uzyskane komercyjnie (patrz Tabela Materiałów).
1. Aktywacja chipa
UWAGA: Wszystkie materiały, które mają być użyte w eksperymencie, są wymienione w Tabeli Materiałów. Wszystkie przygotowane roztwory przefiltrować przez sterylny filtr 0,2 μm.
- Przygotować roztwór 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karmodiimidu (EDC), dodając 2 mg EDC do 2,5 ml 1 M buforu kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES) (pH = 6,0) w probówce o pojemności 15 ml. Przygotować roztwory N-hydroksysulfosukcynimidu (sulfo-NHS), dodając 6 mg sulfo-NHS do 2,5 ml 1 M buforu MES (pH = 6,0) w oddzielnej probówce o pojemności 15 ml. Podamy 50 μl każdego roztworu w niezależnych probówkach i przechowuj w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.
- Wymieszać równe objętości roztworu EDC i sulfo-NHS (50 μL EDC + 50 μL sulfo-NHS) pipetując w górę i w dół (nie wirować).
UWAGA: Zmieszany roztwór EDC/sulfo-NHS należy zużyć w ciągu 30 minut, aby utrzymać skuteczne sieciowanie w celu prawidłowej funkcjonalności chipa.
- Umieść chip biosensora (5,7 cm x 2,4 cm; patrz tabela materiałów) dostarczony przez firmę na szklanej szalce Petriego z dopasowaną pokrywką. Sugeruje się, że wszystkie etapy funkcjonalizacji związane z aktywacją chipa są wykonywane na szalce Petriego. Nanieść 50 μl 1 M buforu MES (pH = 6,0) na chip bioczujnika, inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, a następnie odessać bufor.
- Natychmiast nanieść 50 μl roztworu EDC/sulfo-NHS na chip czujnika. Przykryj szalkę Petriego i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Odessać roztwór EDC/sulfo-NHS z chipa.
- Przepłukać chip jednorazowo 50 μl 1 M buforu MES (pH = 6,0); odessać bufor MES.
2. Docelowa immobilizacja białka
- Wypłucz chip 2x 50 μl 1x PBS (pH = 7,4). Odessać PBS z chipa i dodać cząsteczkę docelową, Hsp90 (50 μL; 500 nM).
UWAGA: Niezgodność bufora może zrujnować cały eksperyment; dlatego przed eksperymentem ważne jest, aby upewnić się, że cząsteczka docelowa znajduje się w tym samym buforze, który jest używany do kalibracji (np. 1x PBS (pH = 7,4)). W razie potrzeby przed eksperymentem należy przeprowadzić wymianę buforu poprzez dializę przez noc. W tym eksperymencie przeprowadzono całonocną dializę dla obu rekombinowanych białek, Hsp90 i Cdc37, przeciwko 1x PBS (pH = 7,4; patrz tabela materiałów) przy prawidłowej wymianie buforu w temperaturze 4 °C. Stężenie materiału docelowego (w tym przypadku Hsp90) może się różnić w zależności od różnych protokołów doświadczalnych i charakteru materiałów docelowych (białko/peptyd/ligandy).
- Przykryj szklaną szalkę Petriego i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Odessać roztwór zawierający cząsteczkę docelową i przepłukać 3x 50 μl 1x PBS (pH = 7,4). Odessać 1x roztwór PBS (pH = 7,4) z chipa.
- Dodać 50 μl roztworu Quench 1 (3,9 mM alkoholu amino-PEG5 w 1x PBS (pH = 7,4)) do chipa. Przykryć szklaną szalkę Petriego i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Zassać roztwór Quench 1 z chipa.
- Dodać 50 μl roztworu Quench 2 (1 M etanoloaminy (pH = 8,5)) do chipa. Przykryj szklaną szalkę Petriego i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Odessać roztwór Quench 2 z chipa i przepłukać chip 5x za pomocą 50 μL 1x PBS, pozostawiając ostatnią kroplę PBS na czujniku.
3. Przygotowanie próbek analitu
- Przygotować serię rozcieńczeń analitu dla Cdc37 w żądanym zakresie stężeń. W pierwszym eksperymencie zastosowano następujące stężenia: 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM, 1000 nM, 2000 nM, 3000 nM i 5000 nM. W drugim eksperymencie zastosowano inny zestaw stężeń w zakresie od 0,4 nM do 200 nM.
- Zaprojektuj eksperyment tak, aby obejmował co najmniej osiem różnych stężeń analitu, aby uzyskać wiarygodną wartość KD. Przygotować różne rozcieńczenia białka analitu w tym samym buforze, który jest używany do kalibracji i białka docelowego; tutaj jest to 1x PBS (pH = 7,4).
4. Wczytywanie aktywowanego chipa biosensora do urządzenia FEB
UWAGA: Urządzenie FEB składa się z czytnika wyposażonego we wskazania świetlne LED oraz wkładu do wkładania chipa biosensora.
- Po unieruchomieniu białka docelowego należy włożyć aktywowany chip do wkładu urządzenia, który jest podłączony przez USB do komputera. Po włożeniu chipa na czytniku zaświeci się zielona dioda LED wskazująca, że urządzenie FEB jest gotowe do eksperymentu. Zainstaluj zautomatyzowane oprogramowanie (patrz tabela materiałów) dostarczone przez firmę na komputerze, do którego podłączone jest urządzenie FEB, aby monitorować eksperyment krok po kroku, jak opisano poniżej.
5. Uruchom eksperyment
- Naciśnij moduł Uruchom eksperyment w zautomatyzowanym oprogramowaniu i wybierz 10 punktów z regeneracją lub dowolny inny żądany protokół. Wypełnij następujące dane: nazwę operatora, nazwę eksperymentu, datę (np. Yana, Hsp90 + Cdc37, 14.03.2021); bufor regeneracyjny (np. bufor PBS); unieruchomiony cel (np. Hsp90); analitu w roztworze (np. Cdc37).
- Naciśnij przycisk Rozpocznij eksperyment wyświetlany na oprogramowaniu i postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi przez automatyczne oprogramowanie, jak opisano poniżej.
nuta: Oprogramowanie jest w pełni zautomatyzowane, przyjazne dla użytkownika i prowadzi użytkownika przez eksperyment krok po kroku. Na ekranie pojawi się wyskakujące okienko z instrukcjami, jak przejść dalej na każdym kroku eksperymentu. Oprogramowanie dostarczy instrukcje dla każdego powtarzalnego kroku kolejno od kalibracji, asocjacji analitu, dysocjacji, regeneracji i płukania (5x) dla każdego stężenia analitu przez cały czas trwania eksperymentu.
- Wykonaj kalibrację przyrządu. W tym celu należy odessać pozostały roztwór PBS z chipa i zastosować 50 μl buforu kalibracyjnego (1x PBS; pH = 7,4). Naciśnij przycisk Kontynuuj i poczekaj 5 minut, aż etap kalibracji zostanie zakończony. Oprogramowanie wyświetla punkt końcowy określony dla etapu kalibracji (5 minut) z alarmem ostrzegawczym w celu podjęcia dalszych działań.
- Następnie wykonaj asocjację analitu. W tym celu należy odessać bufor kalibracyjny z chipa i zastosować 50 μl najniższego stężenia analitu (25 nM Cdc37). Naciśnij przycisk Kontynuuj i poczekaj 5 minut, aż krok asocjacji zostanie zakończony. Oprogramowanie wyświetla punkt końcowy dla kroku asocjacji (5 minut) z alarmem ostrzegawczym, aby kontynuować.
- Wykonaj dysocjację analitu. W tym celu należy odessać roztwór analitu z chipa i nanieść 50 μl buforu dysocjacyjnego (1x PBS; pH = 7,4). Naciśnij przycisk Kontynuuj i poczekaj 5 minut, aż czas trwania etapu dysocjacji (5 minut) zostanie zakończony. Oprogramowanie wyświetla punkt końcowy dla etapu dysocjacji (5 min) z alarmem ostrzegawczym w celu podjęcia dalszych działań.
- Następnie należy przeprowadzić regenerację wiórów. Odessać roztwór dysocjacyjny z chipa i zastosować 50 μl buforu regeneracyjnego (1x PBS; pH = 7,4). Naciśnij przycisk Kontynuuj i poczekaj 30 sekund, aż czas trwania kroku regeneracji (30 s) zostanie zakończony. Oprogramowanie wyświetla punkt końcowy dla etapu regeneracji (30 s) z alarmem ostrzegawczym w celu podjęcia dalszych działań.
- Na koniec umyj frytkę. Odessać roztwór regeneracyjny z chipa i nałożyć 50 μl buforu do przemywania (1x PBS; pH = 7,4) na chip. Odessać roztwór z chipa i powtórzyć to 5 razy. Pozostaw ostatnią kroplę bufora myjącego na chipie, naciśnij przycisk Kontynuuj i poczekaj 30 sekund, aż czas trwania kroku prania zakończy się na wyświetlaczu oprogramowania.
UWAGA: Oprogramowanie wyświetla punkt końcowy dla etapu prania (30 s) z alarmem ostrzegawczym, aby kontynuować następny cykl eksperymentu.
- Powtórz kroki dla każdego użytego stężenia analitu; pięć etapów kalibracji, asocjacji analitu, dysocjacji, regeneracji i płukania (5x) stanowi jeden cykl. W przedstawionym tutaj eksperymencie przeprowadziliśmy 10 cykli dla 10 stężeń analitu (w zakresie od 25 nM do 5 000 nM lub od 0,4 nM do 200 nM; Rysunek 1).
