Techniki detekcji oddziaływań biomolekularnych

W tym filmie opisujemy technologię biodetekcji z efektem polowym (FEB) do wykrywania i ilościowego określania interakcji białko-białko. Białka docelowe unieruchomione na biosensorze grafenu oddziałują z białkami analitu w roztworze, powodując zmiany prądu elektrycznego w systemie FEB. Ta zmiana w odpowiedzi elektrycznej wskazuje na powinowactwo wiązania między białkami.

W tym filmie pokazujemy wykorzystanie fotometrii masowej do badania interakcji antygen-przeciwciało w komorze przepływowej. Skupione światło rozprasza się w różny sposób w zależności od masy cząsteczek. Detektor zbiera rozproszone światło i generuje wzór interferencyjny w postaci plam o różnej intensywności, które korelują z masami cząsteczkowymi.

Film opisuje technikę obrazowania FLIM-FRET w celu określenia interakcji białko-białko w żywych bakteriach wyrażających białka cytoplazmatyczne znakowane białkami fluorescencyjnymi, donorem eGFP i akceptorem mCherry. Połączona technika pozwala również na ilościowe określenie oddziałujących białek.

W tym filmie demonstrujemy technikę pomiaru interakcji międzykomórkowych między cząsteczkami adhezyjnymi komórek synaptycznych za pomocą testu agregacji komórek HEK. W tym teście równa liczba komórek HEK wyrażających pożądaną cząsteczkę adhezyjną komórek presynaptycznych i białko fluorescencyjne jest mieszana z komórkami HEK wyrażającymi postsynaptyczną cząsteczkę adhezyjną komórek i inne białko fluorescencyjne. Interakcja między cząsteczkami adhezyjnymi komórek zmusza komórki do agregacji, co...

Ten film opisuje test ligacji zbliżeniowej do badania in situ interakcji białko-białko w komórkach nicieni. Bliskie sąsiedztwo badanych białek generuje kolistą matrycę DNA za pomocą sondy PLA dołączonej do przeciwciała wtórnego. Sonda jest dalej amplifikowana za pomocą roztworu do amplifikacji, który wytwarza długie, jednoniciowe DNA, a następnie hybrydyzuje sondę detektora, umożliwiając lokalizację interakcji białko-białko w komórkach.

Ten film demonstruje koimmunoprecypitowane kompleksy białkowe na membranie PVDF do analizy interakcji białko-białko. Zredukowane białka z kompleksów potraktowano trypsyną w celu rozszczepienia poszczególnych białek na mniejsze peptydy, a następnie pozostałe peptydy wyekstrahowano z błony PVDF. Wyciągnięty peptyd pochodzący z obu białek w kompleksie został następnie wysuszony i ponownie zawieszony w niskim stężeniu kwasu mrówkowego w celu dalszej analizy.

W tym filmie demonstrujemy technologię interferometrii biowarstw (BLI) do wykrywania interakcji międzycząsteczkowych między ligandami a docelowymi analitami w czasie rzeczywistym. BLI mierzy zmiany we wzorze interferencji światła białego odbitego od warstwy unieruchomionych ligandów na powierzchni biosensora, gdy oddziałują one z analitami w roztworze.

Ten film demonstruje użycie spektroskopii fluktuacji fluorescencji do wykrywania interakcji między białkami na powierzchni komórki na styku komórka-komórka. Poprzez ekspresję transbłonowego receptora adhezyjnego będącego przedmiotem zainteresowania znakowanego białkiem fluorescencyjnym i mieszanie dwóch różnych populacji komórek zawierających dwie spektralnie oddzielone znaczniki fluorescencyjne, trans-interakcja między receptorami dwóch sąsiednich komórek o różnej fluorescencji jest oceniana...

W tym filmie demonstrujemy technikę przeprowadzania ko-immunoprecypitacji oznaczonych przez GFP dzikich i zmutowanych białek PD-1 za pomocą koralików pokrytych przeciwciałami anty-GFP. Białka PD-1-GFP związane z kulkami są inkubowane z białkami SHP2, które oddziałują z PD-1, umożliwiając identyfikację określonych motywów strukturalnych w PD-1, które odgrywają kluczową rolę w interakcji SHP2.

Ten film opisuje technikę opartą na ELISA, która wykrywa interakcje białko-białko między dwoma białkami poprzez pomiar wiązania drugiego białka z unieruchomionym pierwszym białkiem. Związane drugie białko jest wykrywane za pomocą specyficznych przeciwciał znakowanych enzymem, takim jak peroksydaza chrzanowa.

Ten film demonstruje test biosensoryczny konduktometryczny do badania interakcji przeciwciała z docelowym antygenem unieruchomionym na chipie przetwornika. Bioczujnik został zaprojektowany tak, aby zawierał dwufunkcyjne białko chimeryczne – enzym β-laktamazy z funkcjonalnym miejscem katalitycznym połączonym z nanolitem w celu związania się z unieruchomionym antygenem docelowym. Po związaniu katalityczna hydroliza substratu antybiotykowego przez enzym β-laktamazę generuje sygnał elektryczny –...

Ten film demonstruje technikę, która wykorzystuje biotynylowane peptydy penetrujące komórki do wykrywania wewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko. Peptydy penetrujące komórki ułatwiają sprzężonemu peptydowi wnikanie do komórki i specyficzne wiązanie się z oddziałującymi z nią białkami. Biotyna, po związaniu się z awidyną, umożliwia oczyszczenie kompleksu białek oddziałujących z lizatu komórkowego.

Ten film demonstruje test dwóch hybryd drożdży do wykrywania specyficznych interakcji między białkami. W tym teście białko będące przedmiotem zainteresowania jest znakowane do dwóch domen czynnika transkrypcyjnego, który koduje enzym β-galaktozydazy. Kiedy te dwa białka wchodzą w interakcję, powoduje to transkrypcję i translację, które tworzą enzym, który jest następnie wykrywany za pomocą testu biochemicznego.

Ten film demonstruje tandemowe oczyszczanie powinowactwa — technikę oczyszczania kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych w celu zbadania interakcji białko-białko. Kompleks zawiera dwa białka znakowane różnymi znacznikami epitopów. Po oczyszczeniu kompleksu za pomocą dwóch żywic o powinowactwie do dwóch różnych znaczników w sposób sekwencyjny, obecność obu białek w elucie potwierdza oddziaływanie między nimi.

Ten film opisuje technikę powierzchniowego rezonansu plazmonowego, czyli SPR, do badania interakcji między dwiema cząsteczkami za pomocą chipa czujnika. Zmiana kąta rezonansu i natężenie odbitego światła są wykrywane jako funkcja asocjacji i dysocjacji dwóch cząsteczek, a to dostarcza informacji o oddziaływaniach między dwiema cząsteczkami.

Ten film opisuje technikę spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego do badania interakcji białko-białko pomiędzy 15znakowanymi N dzikimi i zmutowanymi białkami envoplakiny a nieznakowanym białkiem wimentyny. Udana interakcja między envoplakiną typu dzikiego a wimentyną prowadzi do rozległego poszerzenia linii i zaniku pików w widmach NMR, podczas gdy brak interakcji między zmutowaną envoplakiną a wimentyną skutkuje dobrze rozdzielonymi pikami w widmach NMR.

W tym filmie demonstrujemy technikę wyświetlania fagów w celu wyizolowania wstępnie zaprojektowanych fagów wyrażających białka o wysokim powinowactwie do docelowego białka.

Ten film demonstruje technikę spektroskopii fluktuacji fluorescencji (FFS) do badania homooligomeryzacji białek. Białka znakowane fluorescencyjnie w próbce są dimeryzowane przy użyciu środka podczas badania oligomeryzacji białek za pomocą FFS. Za pomocą mikroskopu konfokalnego, gdy białka wchodzą i wychodzą z małej objętości obserwacyjnej, przeprowadza się analizę wahań jasności cząsteczek fluorescencyjnych w celu określenia stanu oligomerycznego białek.

Ten film opisuje BiFC-PALM ― połączenie fotoaktywowanej mikroskopii lokalizacyjnej i dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji ― do oceny interakcji białko-białko. BiFC polega na fuzji dwóch fluorescencyjnych fragmentów białek z dwoma oddziałującymi białkami będącymi przedmiotem zainteresowania. Kiedy te dwa białka wchodzą w interakcję, fragmenty są zbliżane do siebie, co pozwala obu częściom połączyć się i odtworzyć funkcjonalne białko fluorescencyjne. Fluorescencja pojedynczego fluoroforu...

W tym filmie opisujemy technikę anizotropii fluorescencji do badania interakcji między białkiem zespołu Shwachmana-Diamonda (SBDS) oznaczonym fluoroforem a czynnikiem wydłużenia 1 GTPazą (EFL1). Podczas inkubacji białek SBDS ze stopniowo rosnącymi stężeniami EFL1 obserwuje się stały wzrost anizotropii, co wskazuje na udaną interakcję między tymi dwoma białkami.

W tym filmie demonstrujemy technikę spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w komórce do badania interakcji białko-ligand między nieznakowanymi białkami o nadekspresji a małymi cząsteczkami. Udana interakcja ligand-białko jest potwierdzona wizualnie przez pojawienie się dodatkowego zestawu pików w obszarze widmowym będącym przedmiotem zainteresowania, który stopniowo zastępuje pierwotne piki.

Ten film demonstruje metodę badania interakcji białko-lek za pomocą biopanowania biblioteki peptydów wyświetlanych przez fagi T7 za pomocą biosensora QCM. Biopanowanie fagów wyświetlających określony peptyd na biosensorze QCM pozwala na specyficzną izolację peptydów o wysokim powinowactwie, a następnie sekwencjonowanie aminokwasów, co pomaga zidentyfikować określone miejsca interakcji na białku docelowym.

Ten film opisuje SEC-MALS, który wykorzystuje możliwości chromatografii wykluczającej rozmiar (SEC) i wielokątowego rozpraszania światła (MALS). W SEC-MALS SEC-MALS SEC rozdziela białka lub kompleksy białkowe na podstawie ich wielkości, a detektor MALS określa średnią masę cząsteczkową, mierząc intensywność światła rozproszonego przez cząsteczkę pod różnymi kątami.

W tym filmie pokazaliśmy oczyszczanie powinowactwa do komplementacji bimolekularnej, BiCAP, do wykrywania i izolowania specyficznych dimerów białkowych za pomocą specyficznych dla konformacji przeciwciał jednodomenowych.

W tym filmie opisujemy test konkurencyjnego wiązania oparty na cytometrii przepływowej, który wykrywa interakcje między receptorem CXC Chemokine Receptor 4 (CXCR4) a jego fluorescencyjnie znakowanym naturalnym ligandem CXC Chemokine Ligand 12 (CXCL12), w obecności małej cząsteczki ukierunkowanej na CXCR4. Inkubacja komórek wykazujących ekspresję CXCR4 o niższych stężeniach małych cząsteczek umożliwia wiązanie CXCR4-CXCL12 do pewnego stopnia, które stopniowo zmniejsza się wraz ze stopniowym...

Ten film demonstruje wykrywanie interakcji receptor-ligand za pomocą testu reporterowego. Udana interakcja receptor-ligand aktywuje dalszy szlak sygnałowy, powodując wytwarzanie i uwalnianie cytokin jako wydzielniczych cząsteczek reporterowych w roztworze, co potwierdza się za pomocą testu ELISA.

W tym filmie sondy siły biomembranowej (BFP) są używane do pomiaru sił między receptorami i ligandami. Technika ta może wykrywać interakcje poprzez monitorowanie ciśnienia potrzebnego do zerwania wiązań między pMHC sprzężonym na kulkach sondy a TCR na komórkach docelowych.

Ten film demonstruje test konkursowy do badania partnerów białkowych wiążących GTPazę. Wykorzystując białko GTPazy związane z nukleotydami unieruchomione na kulkach magnetycznych, można badać konkurencyjne wiązanie między dwoma oddziałującymi partnerami białkowymi dla tego samego miejsca wiązania na GTPazie w celu oceny powinowactwa wiązania partnerów białkowych.

W tym filmie pokazujemy proces wykrywania izotypów przeciwciał w wielu próbkach ludzkiej surowicy za pomocą szkiełka mikromatrycowego wydrukowanego z antygenowymi podtypami szczepów wirusa grypy.

W tym filmie demonstrujemy test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej do wykrywania interakcji białko-DNA za pomocą sond DNA znakowanych fluorescencyjnie w podczerwieni. Kiedy białko wiąże się z sondą DNA, tworzy duży kompleks, który migruje powoli i pojawia się jako przesunięta prążek na żelu.

W tym filmie demonstrujemy technikę immunoprecypitacji chromatyny w celu identyfikacji miejsc wiązania białek w określonych regionach genomowego DNA komórek prekursorowych oligodendrocytów poprzez selektywną immunoprecypitację fragmentów chromatyny związanych z białkiem. Metoda ta pomaga badać interakcje kilku białek regulatorowych, w tym czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w regulację genów.

Ten film opisuje wysoce wydajną anizotropię fluorescencji, która pomaga monitorować interakcję między czynnikami transkrypcyjnymi a DNA. Test monitoruje interakcje cząsteczki DNA znakowanej fluoroforem z jej specyficznym czynnikiem transkrypcyjnym, mierząc stopień polaryzacji spowodowanej rotacją molekularną lub anizotropią DNA znakowanego fluoroforem.

Ten film demonstruje test in vivo na bakteriach w celu zbadania interakcji białek wiążących RNA (RBP) z RNA. Komórki bakteryjne są przekształcane za pomocą dwóch konstruktów plazmidowych - plazmidu miejsca wiązania kodującego mRNA zawierającego fluorescencyjny gen reporterowy za miejscem wiązania RBP - podczas gdy plazmid RBP ulega ekspresji białek RBP pod kontrolą induktora. Po wzroście produkcji RBP za pośrednictwem induktora, RBP wiążą się z mRNA, powodując translacyjną represję reportera...

W tym filmie demonstrujemy zmodyfikowany test hybrydowy drożdży, który wykrywa wiele białek oddziałujących z docelowym DNA. Przekształcone komórki drożdży zawierają docelową sekwencję DNA przed genem reporterowym. Dodatkowo wykazują ekspresję białek czynnika transkrypcyjnego. Kiedy białka tworzą kompleksy i wiążą się z docelowym DNA, gen reporterowy ulega ekspresji i może być wykryty enzymatycznie.

W tym filmie demonstrujemy procedurę określania aktywności helikazy docelowego białka w celu rozwinięcia znakowanego biotyną substratu dsRNA. Aktywność enzymu zidentyfikowano poprzez analizę przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej, a następnie test chemiluminescencyjny przy użyciu chemiluminescencyjnej streptawidyny sprzężonej z enzymem.

W tym filmie opisujemy metodę immunofluorescencji, aby zobrazować lokalizację białek naprawy DNA γH2AX i 53BP1 w miejscach pęknięć dwuniciowego DNA w napromieniowanych jądrach komórkowych.

Ten film demonstruje test in vitro do ekstrakcji RNA w celu identyfikacji białek wiążących RNA (RBP), które oddziałują z sekwencjami elementów bogatych w adenylan-urydylan (ARE) w mRNA. Docelowe RBP z lizatu komórkowego miesza się z sondą RNA w celu utworzenia kompleksów RNA-białko. Kompleksy izoluje się poprzez oczyszczanie powinowactwa z wykorzystaniem powinowactwa znacznika destiobiotyny sondy RNA do kulki magnetycznej znakowanej streptawidyną.

W tym filmie opisujemy systematyczną ewolucję ligandów metodą wykładniczego wzbogacania (SELEX) w celu identyfikacji specyficznych sekwencji wiążących RNA dla docelowego białka. Białko jest inkubowane z dużą pulą randomizowanych sekwencji RNA, a sekwencje RNA wiążące białka są izolowane, amplifikowane PCR i sekwencjonowane w celu zidentyfikowania ich miejsc wiązania białek.

Ten film opisuje metodę wizualizacji montażu kondensatów białek fuzyjnych na cząsteczkach DNA w określonych loci za pomocą obrazowania pojedynczych cząsteczek. Kondensaty te powstają w wyniku oddziaływań LCD-LCD i LCD-DBD, które pozwalają na rekrutację polimerazy RNA II i zwiększoną transkrypcję genów.

Ten film demonstruje różnicową kalorymetrię skaningową - technikę badania interakcji między biomolekułą a ligandem. Wiązanie aptameru DNA i liganda termolabilnego bada się poprzez zastosowanie powtarzających się cykli ogrzewania i chłodzenia do próbki oraz uzyskanie skanów do analizy termodynamicznej.

Ten film demonstruje termoforezę w mikroskali do badania interakcji białko-lipid. Test wykrywa interakcję między cząsteczkami poprzez ilościowe określenie ruchu termoforetycznego białek znakowanych fluorescencyjnie w odpowiedzi na gradient temperatury. Cząsteczka fluorescencyjna jest mieszana z różnymi stężeniami niefluorescencyjnych cząsteczek lipidów, a mieszanina cząsteczek w roztworze jest ładowana do naczyń włosowatych. Do próbek w kapilarach stosuje się gradient temperatury, a ruch...

W tym filmie pokazujemy interakcję między białkami a sztucznymi pęcherzykami fosfolipidowymi za pomocą ilościowej cytometrii przepływowej. Wiązanie białek znakowanych fluorescencyjnie z pęcherzykami fosfolipidowymi znakowanymi fluorescencyjnie zwiększa średnią intensywność fluorescencji, a wzrost ten jest wykrywany przez cytometr przepływowy.

Ten film demonstruje technikę dyssypatywnej mikrograwimetrii do badania wiązania białek z dwuwarstwami lipidów. Małe pęcherzyki jednowarstwowe są dodawane w celu pokrycia powierzchni czujnika kwarcowego mikrowagi. Wykorzystując zależne od jonów wapnia wiązanie docelowego białka wiążącego fosfolipidy z dwuwarstwą, monitorowane są zmiany częstotliwości oscylacji czujnika i rozproszenie oscylacji w celu określenia charakteru wiązania dwuwarstwy białkowo-lipidowej.

W tym filmie demonstrujemy interakcje białko-fosfoinozytyd we wzorcu mikroprzepływowym za pomocą testu modulacji pH, używając wrażliwego na pH barwnika fluorescencyjnego oznaczonego lipidem fosfatydyloetanoloaminy w dwuwarstwie lipidowej, zwanej platformą mikroprzepływową. Modulacje pH po związaniu białka z fosfolipidem powodują wygaszanie fluorescencji.