1. Przygotuj komory przepływowe
- Wyczyść szklane szkiełka nakrywkowe
- Używając butelek do mycia wodą destylowaną, etanolem i izopropanolem, wypłucz szkiełka nakrywkowe o wymiarach 24 mm x 50 mm w następującej kolejności: woda, etanol, woda, izopropanol, woda. Osusz szkiełka nakrywkowe strumieniem czystego azotu. Ważne jest, aby spłukać szkiełka nakrywkowe od góry do dołu, przytrzymując dolny róg miękko zakończonymi kleszkami. Wysuszyć szkiełko nakrywkowe w tym samym kierunku, aby uniknąć przenoszenia zanieczyszczeń z kleszczy (Rysunek 1A).
- Podobnie spłucz szkiełka nakrywkowe o wymiarach 24 mm x 24 mm wodą destylowaną, etanolem i wodą destylowaną. Osusz szkiełka nakrywkowe strumieniem czystego azotu.
- Zidentyfikuj stronę roboczą szkiełka nakrywkowego, umieść kroplę wody destylowanej na powierzchni czystego szkiełka nakrywkowego i postępuj zgodnie z krokami 3.1–3.2 protokołu. Zazwyczaj tylko jedna strona szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 mm x 50 mm ma jakość optyczną odpowiednią do pomiarów MP.
nuta: Po ustawieniu ostrości nie powinny być wykrywalne żadne znaczące niedoskonałości powierzchni, a wartość "sygnału" pokazana w oprogramowaniu do zbierania danych powinna być mniejsza niż 0,05% (rysunek 2A-C). Boki robocze wszystkich szkiełek nakrywkowych w pudełku są zorientowane w tym samym kierunku. Tę samą procedurę należy zastosować do zbadania skuteczności czyszczenia szkiełek nakrywkowych.
- Zmontuj komorę przepływową
- Umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 mm x 24 mm na kawałku folii aluminiowej. Umieść paski taśmy dwustronnej na wierzchu szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 mm x 24 mm, jak pokazano na rysunku 1B i przetnij taśmę wzdłuż krawędzi szkła. Oddziel szkiełko nakrywkowe od folii aluminiowej i przymocuj je do strony roboczej szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 mm x 50 mm (Rysunek 1C).
nuta: Rozmiar kanału może się różnić, ale zalecana jest szerokość 3–5 mm. Szersze kanały wymagają większych objętości próbek, a bardzo wąskie kanały mogą być trudne do załadowania. Zazwyczaj na szkiełku nakrywkowym o wymiarach 24 mm x 24 mm można łatwo utworzyć dwa równoległe kanały. W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu.
2. Przygotuj próbki przeciwciał i antygenów do pomiarów powinowactwa
- Przefiltrować co najmniej 2 ml buforu PBS za pomocą filtrów strzykawkowych 0,22 μm w celu usunięcia cząstek pyłu lub osad. Odwirowywać białko przez 10 minut z maksymalną prędkością wirówki stołowej (około 16 000 x g).
nuta: PBS jest zalecanym buforem dla tego protokołu, ale MP nie ma szczególnych wymagań dotyczących, a inne biologiczne są również dopuszczalne. Jednak wysokie stężenia glicerolu (>10%) i bardzo niskie stężenia jonów (stężenie soli <10 mM) mogą wpływać na jakość obrazu i danych i nie są zalecane.
- Określić rzeczywiste stężenia zapasów przeciwciał i antygenów, mierząc ich absorbancję UV 280 nm.
- Obliczyć zmierzone stężenia mieszaniny antygen-przeciwciało. Jeżeli szacowana wartość powinowactwa wiązania przeciwciał nie jest znana, należy zaplanować przygotowanie próbki z antygenem 30 nM i stężeniem przeciwciał 20 nM. Gdy znane jest przybliżone powinowactwo, stosunek przeciwciał do antygenu i ich stężenia należy zoptymalizować zgodnie z oczekiwanymi wartościami Kd. Zastosować całkowite stężenie antygenu w mieszaninie równe sumie oczekiwanego Kd i całkowitego stężenia przeciwciał w poniższym równaniu. Zakładając, że Kd1 = Kd2 dla dwóch paratopów przeciwciała, otrzymamy porównywalne stężenia wolnego przeciwciała i kompleksów przeciwciało-antygen w próbce.
Dostosuj stężenie przeciwciał, aby utrzymać całkowite stężenie białka w próbce w zakresie od 10 nM do 50 nM. Najlepsze wyniki uzyskuje się stosując mieszaniny o stężeniach przeciwciał od 5 nM do 25 nM.
nuta: MP wykrywa białka o masie cząsteczkowej większej niż 40 kDa. W związku z tym stężenia antygenów w próbkach o masie cząsteczkowej mniejszej niż 40 kDa mogą przekroczyć typowy limit 50 nM. Jednak przy stężeniach wyższych niż około 100 nM nawet antygeny o niskiej masie cząsteczkowej mogą wpływać na jakość obrazu i dokładność oznaczania Kd.
- Przygotować 50 μl mieszaniny przeciwciało-antygen o końcowym stężeniu pomiarowym obliczonym w kroku 2.3.
nuta: Do oznaczenia Kd wymagana jest tylko jedna próbka mieszaniny antygen-przeciwciało. Jednak przygotowanie kilku próbek o różnych proporcjach antygenu do przeciwciała może pomóc w optymalizacji stężenia próbki. Jeśli zbierane są dane z kilku próbek, można je analizować za pomocą dopasowania globalnego.
- Inkubować mieszaninę(-y) antygenu i przeciwciała przez około 10 minut w temperaturze pokojowej, aby reakcja wiązania osiągnęła równowagę chemiczną. Unikaj niepotrzebnie długiego czasu inkubacji.
nuta: Czas inkubacji może się różnić w zależności od kinetyki wiązania. Aby potwierdzić, że równowaga chemiczna została osiągnięta, pomiary próbki można powtórzyć w różnych czasach inkubacji. Niezmienne w czasie wartości Kd wskazują na wystarczająco długą inkubację. Długotrwała inkubacja może prowadzić do znacznej adsorpcji białek na powierzchni plastikowego sprzętu laboratoryjnego, a w konsekwencji do znacznych błędów w oznaczaniu stężenia białka. Z tego powodu do przygotowania próbek MP zdecydowanie zaleca się stosowanie przyborów laboratoryjnych o niskiej przyczepności.
3. Zbierz dane z fotometrii masowej
- Nałóż kroplę olejku immersyjnego do mikroskopu na obiektyw instrumentu MP i umieść zmontowaną komorę przepływową na stoliku mikroskopu. Upewnij się, że olej rozciąga się na szczelinie między szkiełkiem nakrywkowym a obiektywem.
- Załaduj komorę przepływową i ustaw ostrość fotometru masy.
- Umieścić 10 μl czystego, przefiltrowanego roztworu buforowego na jednym końcu kanału komory przepływowej przygotowanego w kroku 1. Ciecz dostanie się do kanału przez działanie kapilarne.
- Wyreguluj położenie Z stolika, aby ustawić ostrość mikroskopu na powierzchni roboczej szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 x 50 mm.
- Na karcie Focus Control w oprogramowaniu do zbierania danych użyj przycisków ruchu zgrubnego stage w górę i w dół, aby dokonać początkowych regulacji.
- Kliknij przycisk Ostrość, aby wyświetlić odczyt sygnału ostrości i użyj precyzyjnych przycisków regulacji w górę i w dół, aby zmaksymalizować wartość ostrości.
- Kliknij przyciski Ustaw ostrość i Zablokuj ostrość, aby aktywować funkcję śledzenia ostrości. Prawidłowo ostry obraz (Rysunek 2A, C) powinien mieć wartość "sygnału" poniżej 0,05%.
nuta: Jeśli wartość "sygnału" w pozycji maksymalnej ostrości jest wyższa niż 0,05%, może to wskazywać na zanieczyszczenia na powierzchni szkła lub w buforze.
- Korzystając z tego samego kanału, załaduj 20 μl próbki przeciwciała-antygenu, umieszczając ją po jednej stronie kanału i osuszając płyn z drugiego końca małym kawałkiem bibuły (rysunek 1D).
nuta: Objętość kanału o szerokości 3–5 mm wynosi około 10 μl. Dodatkowa objętość próbki jest zalecana w celu całkowitego zastąpienia buforu znajdującego się w kanale i uniknięcia rozcieńczenia próbki.
- Po załadowaniu próbki natychmiast kliknij przycisk Nagraj, aby rozpocząć zbieranie danych, uzyskując 100-sekundowe wideo (Rysunek 2D).
- Na końcu zbierania danych wprowadź nazwę pliku i kliknij przycisk OK, aby zapisać plik danych.
- Wyrzuć szkiełka nakrywkowe i wytrzyj olej z soczewki obiektywu bawełnianymi wacikami optycznymi zwilżonymi izopropanolem.
nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
4. Analizuj dane MP
- Przetwarzaj zebrany plik wideo za pomocą oprogramowania do przetwarzania danych MP w celu zidentyfikowania zdarzeń lądowania.
- Użyj opcji menu Plik/Otwórz, aby załadować plik do analizy i kliknij przycisk Analizuj.
- Kliknij przycisk Załaduj, aby załadować funkcję kalibracji i zapisać analizowane dane za pomocą opcji menu Plik/Zapisz wyniki jako.
- Dopasuj rozkład masy cząsteczkowej do funkcji Gaussa, aby uzyskać względne stężenia każdego gatunku w próbce. Analizę tę można przeprowadzić za pomocą popularnego oprogramowania do tworzenia wykresów naukowych (patrz tabela materiałów).
- Zaimportuj plik "eventsFitted.csv" do oprogramowania i wykreśl rozkład masy cząsteczkowej (kolumna M w pliku .csv) za pomocą funkcji Wykres/Statystyka/Histogram
.
- Kliknij dwukrotnie histogram, aby otworzyć okno Właściwości działki. Wyłącz automatyczne kategoryzowanie i wybierz rozmiar pojemnika 2,5 kDa. Kliknij przyciski Zastosuj i Przejdź, aby utworzyć dane Centra pojemników i Inwentaryzacje.
- Wybierz kolumny Centra pojemników i Liczności, a następnie użyj funkcji menu Analiza/Piki i Linia bazowa/Dopasowanie wielu szczytów, aby dopasować histogram do funkcji Gaussa. Kliknij dwukrotnie, aby wskazać przybliżone pozycje pików na wykresie rozkładu, a następnie kliknij przycisk Otwórz NLFit.
- Zaznacz pola wyboru Stałe dla centrów pików "xc" i ustaw ich wartości na oczekiwane masy cząsteczkowe wolnego przeciwciała oraz pojedynczych i podwójnych kompleksów antygen-przeciwciało. Zaznacz opcję Udostępnij dla parametrów szerokości. Kliknij przycisk Dopasuj. Dopasowane wartości wysokości pików składników Gaussa reprezentują względne stężenie każdego gatunku w próbce.
nuta: Rozmiar pojemnika można dostosować w celu optymalizacji rozdzielczości wykresu rozkładu masy. Limit precyzji MP wynosi około 1 kDa, a mniejsze rozmiary pojemników mogą wzmacniać szum rozkładu, nie ujawniając żadnych dodatkowych informacji. Bardzo duże rozmiary pojemników zasłaniają drobne szczegóły rozkładu masy.
- Obliczyć frakcję stężeniową każdego gatunku, korzystając z następującego równania:
gdzie wartości HI i F I reprezentują wysokości pików i frakcje stężenia odpowiednio wolnego przeciwciała oraz przeciwciała jedno- i podwójnie związanego w próbce.
