$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie podkładki agarozowej (Rysunek 1)
- Umieść szkiełko mikroskopowe na płaskiej poziomej powierzchni. Ułóż dwa szkiełka podstawowe pokryte dwiema warstwami taśmy klejącej po każdej stronie początkowego slajdu.
nuta: Zachowaj odstęp 1-2 mm między trzema wyrównanymi szkiełkami, aby zapobiec ostatecznemu rozlaniu się stopionej agarozy na szkiełkach za pomocą taśmy klejącej.
- Odpipetować i wlać kroplę 70 μl 1% stopionej agarozy na szkiełko podstawowe. Dodaj czwarte szkiełko na górze, aby spłaszczyć kroplę agarozy i delikatnie dociśnij. Poczekaj około minuty.
- Zdjąć górne szkiełko i wrzucić pipetą około 3 μl bakterii do 3 do 4 miejsc w różnych miejscach na podkładkę agarozową.
- Przykryj szkiełkiem nakrywkowym ze szkła mikroskopowego (na przykład o grubości 22x22 mm #1,5).
nuta: Płaskość i grubość szkiełek nakrywkowych są ważne przy pracy ze wzbudzeniami dwufotonowymi. Precyzyjne szkiełka nakrywkowe o kontrolowanej jednolitej płaskości i niskiej autofluorescencji są zwykle dobrym wyborem.
- Przymocuj szkiełko nakrywkowe za pomocą stopionej parafiny, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym. Zacznij od zamocowania czterech rogów szkiełka nakrywkowego.
2. Obrazowanie za pomocą mikroskopii dwufotonowej
UWAGA: Używamy domowej roboty dwufotonowego skaningowego mikroskopu odwróconego do wzbudzenia z obiektywem 60x 1.2NA, działającym w trybie zbierania fluorescencji bez skanów. Długość fali wzbudzenia dwufotonowego jest ustawiona na 930 nm. Zapewnia to laser Ti:Sapphire (częstotliwość powtarzania 80 MHz, ≈ szerokość impulsu 70 fs) pracujący z mocą 10-20 mW. Fotony fluorescencji zebrano przez filtr krótkoprzepustowy 680 nm i filtr pasmowo-przepustowy 525/50 nm, a następnie skierowano do fotodiody lawinowej sprzężonej ze światłowodem podłączonej do skorelowanego czasowo modułu zliczania pojedynczych fotonów (TCSPC). Mikroskop wyposażony jest również w transmisyjną lampę fluorescencyjną. Kilka mikroskopów FLIM-FRET jest obecnie dostępnych na rynku, a wiele urządzeń do obrazowania jest wyposażonych w zestawy zdolne do wykonywania pomiarów FLIM-FRET.
- Użyj lampy fluorescencyjnej, aby ustawić ostrość obiektywu na monowarstwie bakterii w próbce i wybierz obszary zainteresowania.
- Sprawdź, czy migawka lasera wzbudzającego jest zamknięta i czy światło podczerwone pochodzące z lasera jest zablokowane i nie dostaje się do mikroskopu.
ostrożność: Podczas pracy z laserami impulsowymi w podczerwieni należy zachować szczególną uwagę i stałą czujność, ponieważ światło lasera nie jest widoczne dla oczu, ale każda, a nawet przejściowa bezpośrednia ekspozycja lub odbicie lasera może być niezwykle szkodliwe i spowodować nieodwracalne uszkodzenie oczu. Przed użyciem zestawów mikroskopowych należy zapoznać się z lokalnymi procedurami bezpieczeństwa i szkoleniami dotyczącymi lasera.
- Umieść szkiełko mikroskopowe na stoliku tak, aby szkiełka nakrywkowe były skierowane w stronę obiektywu.
- Sprawdź, czy lampka fluorescencyjna jest włączona.
- Obróć wieżyczkę kostki filtra, aby wybrać kostkę eGFP i otwórz przesłonę lampy fluorescencyjnej.
- Wyślij światło fluorescencyjne w kierunku okularu mikroskopu.
Ostrzeżenie: Upewnij się, że odpowiednie filtry są usuwane na ścieżce światła, aby usunąć bezpośrednie światło wzbudzenia pochodzące z lampy fluorescencyjnej, które może uszkodzić oczy.
- Ustaw ostrość obiektywu na bakteriach za pomocą pokrętła mikroskopu.
- Wybierz obszar zainteresowania w próbce, tłumacząc go za pomocą joysticka sterującego zmotoryzowanym stolikiem
nuta: Ustawianie ostrości jest łatwiejsze w przypadku próbek o wysokiej fluorescencji, dzięki czemu fluorescencja jest widoczna bezpośrednio oczami.
- Przełącz wzbudzenie dla lasera 2PE na pomiary FLIM-FRET.
- Wyślij ścieżkę emisji fluorescencji z powrotem w kierunku detektora.
- Obróć do tyłu wieżyczkę kostki filtra, aby wybrać kostkę dichroiczną dla lasera 930 nm.
- Ustaw moc lasera na 20 mW.
- Ustaw rozmiar obszaru zainteresowania na 30 μm. Ta operacja reguluje napięcie sterujące lustrami galwicznymi i określa zakres ich ruchów (rysunek 2).
- Włącz detektor i rozpocznij skanowanie próbki - przyciski start i stop sterujące skanowaniem sterują również otwieraniem i zamykaniem migawki laserowej, zarówno ze względów bezpieczeństwa, jak i w celu ograniczenia fotowybielania próbki (rysunek 2).
- W razie potrzeby wyreguluj ostrość, lekko przesuwając pokrętło precyzyjnej ostrości mikroskopu.
- Wybierz pole widzenia do obrazowania, przesuwając precyzyjnie stolik z interfejsu komputera. Można to zrobić podczas ustawiania, przesuwając krzyżyk na obrazie w oprogramowaniu sterującym mikroskopem (Rysunek 2), które określi nowy środek obrazu, i naciskając "Przesuń stolik". Dobre pole widzenia do akwizycji odpowiada obrazowi z 10-30 nieruchomymi bakteriami, z których wszystkie są prawidłowo zogniskowane (wszystkie bakterie znajdują się na tej samej płaszczyźnie). Jeśli jesteś zainteresowany ekstrakcją danych FLIM-FRET z pojedynczych komórek, upewnij się, że bakterie są dobrze zindywidualizowane (segmentacja obrazu będzie znacznie łatwiejsza).
