Test agregacji komórek w celu wykrycia interakcji trans między cząsteczkami adhezyjnymi komórek

Abstract

Źródło: Restrepo, S., et al., Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System. J. Vis. Exp. (2020)

W tym filmie demonstrujemy technikę pomiaru interakcji międzykomórkowych między cząsteczkami adhezyjnymi komórek synaptycznych za pomocą testu agregacji komórek HEK. W tym teście równa liczba komórek HEK wyrażających pożądaną cząsteczkę adhezyjną komórek presynaptycznych i białko fluorescencyjne jest mieszana z komórkami HEK wyrażającymi postsynaptyczną cząsteczkę adhezyjną komórek i inne białko fluorescencyjne. Interakcja między cząsteczkami adhezyjnymi komórek zmusza komórki do agregacji, co można zmierzyć za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Protocol

1. Hodowla komórkowa i transfekcja

1. Zrób pożywkę komórkową HEK z DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) uzupełnioną 4,5 g / L glukozy, L-glutaminą i pirogronianem sodu oraz 10% FBS. Sterylny filtr.
2. Z góry określ odpowiednie ligandy i receptory do testu agregacji.
   nuta: W tym badaniu wykorzystano Neurexin3α SS4+/- i jeden z jego znanych ligandów, LRRTM2. Ligandy i receptory będące przedmiotem zainteresowania ulegały ekspresji z cDNA w pcDNA3.1. Do wprowadzenia Neurexin3α do pcDNA3.1 użyto zespołu Gibsona. Neurexin3α F/R:
   TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCACTC/
   GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT.
3. Przygotuj HEK293T komórek.
   1. Wyhoduj HEK293T komórek do zbiegu w jednej kolbie T-75.
   2. Po zlaniu się użyj 2 ml trypsyny i umieść w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 2 minuty. Dodaj 6 ml pożywki HEK do kolby w celu ponownego zawieszenia komórek i przenieś wszystkie 8 ml do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
   3. Osad w dawce 500 x g przez 5 minut i ponownie zawieś w pożywce komórkowej HEK, w sumie 8 ml.
   4. Policz komórki i dodaj 735 000 komórek do każdego dołka na 6-dołkowej płytce. Dostosuj końcową objętość do 2 ml dla każdej studzienki za pomocą pożywki komórkowej HEK.
   5. Umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C i pozwolić komórkom rosnąć przez noc lub do momentu, gdy osiągną 50-60% zlewności.
4. Transfekcja komórek HEK293T metodą fosforanu wapnia.
   1. Transfekcja well-1 z 3 μg białka będącego przedmiotem zainteresowania i kotransfekcja z 1 μg białka fluorescencyjnego (3 μg pcDNA3.1-Neurexin3α^WT SS4- i 1 μg mCherry).
   2. Transfekcja well-2 jak w kroku 1.4.1, ale ze zmutowanym białkiem będącym przedmiotem zainteresowania (pcDNA3.1-Neurexin3α^A687T SS4-).
   3. Transfekcja well-3 z 3 μg ligandu będącego przedmiotem zainteresowania i kotransfekcja z 1 μg innego białka fluorescencyjnego (3 μg pcDNA3.1 LRRTM2 i 1 μg GFP).
   4. Przepuszczalne basenie 4 i 5 służące jako kontrole negatywne: basenik 4 z 1 μg GFP i basenik 5 z 1 μg mCherry.
   5. Przygotować kolejną płytkę (jak w krokach 1.4.1-1.4.4), jeśli wymaga to dodatkowych warunków lub kontroli (Neurexin3α^WT/A687T SS4+).
      nuta: Skuteczność transfekcji jest analizowana 24 godziny po transfekcji pod mikroskopem epifluorescencyjnym i określana ilościowo jako liczba komórek wyrażających białko fluorescencyjne, którym zostały transfekowane. Bardziej uproszczone podejście obejmowałoby transfekcję komórek HEK z wektorem bicystronicznym kodującym białko fluorescencyjne i ligand będący przedmiotem zainteresowania i jest wysoce zalecane przed kotransfekcją. W przypadku tego badania alfa neureksyny mają ~4,3 kb i zaobserwowano niską intensywność fluorescencji przy użyciu systemu bicystronicznego wymagającego kotransfekcji.
5. 48 godzin po transfekcji zbierz komórki do agregacji.
   1. Umyj każdą studzienkę dwukrotnie za pomocą PBS.
   2. Dodać 1 ml 10 mM EDTA w PBS do każdej studzienki, aby delikatnie dysocjować interakcje międzykomórkowe i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 5 min.
      nuta: Trypsyna nie jest zalecana w kroku 1.5.b ze względu na potencjalne proteolityczne rozszczepienie cząsteczek adhezyjnych w badaniu. Dodatkowo, po dodaniu EDTA, protokół może nie zostać zatrzymany do czasu zakończenia, ponieważ komórki będą teraz wystawione na działanie warunków otoczenia.
   3. Delikatnie postukaj w płytkę, aby odłączyć komórki, i zbierz każdą z nich do oddzielnych stożkowych probówek o pojemności 15 ml.
   4. Odwirować stożkowe probówki o sile 500 x g i temperaturze pokojowej przez 5 min.
6. Podczas granulowania komórek przygotuj 6 probówek inkubacyjnych, oznaczając górną część każdej probówki mikrowirówki każdym warunkiem.
   nuta: Każda permutacja warunków GFP i mCherry powinna być stosowana w celu uwzględnienia wszystkich warunków doświadczalnych i odpowiednich kontroli. Na przykład: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3α^WT SS4-—mCherry, 4. GFP/Neurexin3α^A687T SS4- –mCherry, 5. Neurexin3α^WT SS4-—mCherry/LRRTM2—GFP, 6. Neurexin3α^A687T SS4- –mCherry/LRRTM2—GFP. Wykonaj dodatkowe rurki, aby dostosować się do dalszych warunków i kontroli.
7. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl pożywki HEK z 10 mM CaCl₂ i 10 mM MgCl₂ ogrzanymi do 37 °C.
   nuta: Dodanie CaCl₂ i MgCl₂ umożliwia cząsteczkom adhezyjnym ponowne nawiązanie wiązania i jest wymagane tylko wtedy, gdy partnerzy interakcji transkomórkowej, o których mowa, wymagają kationów dwuwartościowych do adhezji.
8. Policz komórki w każdej stożkowej probówce o pojemności 15 ml za pomocą hemocytometru i podnieś 200 000 komórek każdego stanu do odpowiedniej probówki z kroku 1.6, aby uzyskać mieszaninę 1:1 w całkowitej objętości 500 μl.
   nuta: Zliczenie i podwielokrotnienie ilości powinno zająć tylko 5 minut na warunek.
9. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej w powolnym rotatorze probówkowym.

2. Akwizycja obrazu

1. Zoptymalizuj parametry akwizycji mikroskopu dla określonych próbek. W tym przykładzie obrazy zostały wykonane pod mikroskopem szerokokątnym. Użyj obiektywu powietrznego 5x (NA: 0.15; WD: 20000 μm), aby uzyskać wystarczająco duże pole do analizy.
2. Oceń agregację wyjściową natychmiast po zmieszaniu dwóch warunków komórek HEK w kroku 1.8. To są teraz obrazy "czasu zero".
   1. Pobrać pipetę 40 μl każdej mieszaniny próbki na naładowane szkiełko mikroskopowe i obrazować pod wpływem fluorescencji w kanałach 488 i 561.
   2. Uzyskaj trzy różne pola widzenia na jednej płaszczyźnie ostrości na kroplę próbki.
3. Uzyskaj końcowe obrazy po 60 minutach jako obraz "czas 60".
   1. Aby uzyskać obraz mieszaniny w czasie 60 po 60 minutach inkubacji, należy pobrać kolejną próbkę o objętości 40 μl z każdego stanu z obracających się probówek i pipetować każdą próbkę na naładowane szkiełko. Obraz jak w kroku 2.2.
      nuta: Agregację komórek należy sprawdzać co 15 minut, aż do momentu nasycenia. Czas agregacji będzie zależał od badanych białek.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Jednorazowe mikroprobówki 5 ml z zatrzaskami	Firma VWR	89000-028	Inkubacja mieszanej populacji komórek HEK
Jednostka filtrująca o szybkim przepływie 1000 ml, membrana aPES 0,2 μm	Rybak termiczny	567-0020	Sterylizacja pożywek HEK
Probówki wirówkowe SpectraTube o pojemności 15 ml	Nauka Warda	Numer telefonu 470224-998	Pobieranie komórek HEK
6-dołkowe sterylne płytki do hodowli tkanek	Firma VWR	Numer katalogowy: 100062-892	Hodowla komórek HEK
Chlorek wapnia	Sigma	223506-500G	Transfekcja fosforanu wapnia, zawieszenie komórek HEK
Wirówka - Sorvall Legend RT	Produkty laboratoryjne Kendro	75004377	Pobieranie komórek HEK
Inkubator zkomórkami CO 2	Thermo Scientific	HERACELL 150i	Inkubacja komórek HEK podczas wzrostu
DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) z 4,5 g/L glukozy, L-glutaminą i pirogronianem sodu	Corning	10-013-CV	Konserwacja komórek HEK
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami PBS firmy Dulbecco (1X)	Gibco (firma Gibco)	Nr kat. 14190-144	Pasażowanie/zbieranie komórek HEK
Kwas etylenodiaminotetraoctowy	Sigma	ED-500G (Biblioteka ED-500G	Pobieranie komórek HEK
Kolby hodowlane Falcon Vented, powierzchnia wzrostu 75 cm2	Corning	9381M26	Hodowla komórek HEK
Surowica bydlęca płodu	Sigma	Numer katalogowy: 17L184	Konserwacja komórek HEK
HEK293T komórek	Kontroler ATCC (Kontroler T		Układ modeli
ObrazJ	Nih	Wersja V: 2.0.0-rc-69/1.52p	Analiza obrazu
Chlorek magnezu sześciowodny	Sigma	Zobacz materiał M9272-500G	Ponowne zawieszenie komórek HEK
Sód fosforan dwuzasadowy bezwodny	Odczynniki biologiczne Fisher	Zobacz materiał BP332-500	Transfekcja fosforanu wapnia
Trypsyna 0,25% (1X) Roztwór	GE Healthcare Nauki przyrodnicze	SH30042.01	Pasażowanie komórek HEK
Rotator rurowy			Inkubacja mieszanej populacji komórek HEK
Szkiełka mikroskopowe UltraClear. Biały matowy, naładowany dodatnio	Denville Scientific Inc.	Zobacz materiał M1021	Akwizycja obrazu
Mikroskop szerokokątny	Zeiss	Axio Vert 200M	Akwizycja obrazu