UWAGA: Ten protokół wykorzystuje szczepy C. elegans, w których obaj potencjalni partnerzy są oznaczeni. Zdecydowanie zaleca się stosowanie szczepu kontroli ujemnej, w którym nie oczekuje się, że jedno znakowane białko będzie wchodzić w interakcje z innym oznakowanym potencjalnym partnerem interakcji. W tym przypadku sama GFP została wykorzystana jako kontrola negatywna do oceny tła, ponieważ nie oczekuje się, że DLC-1 będzie wchodzić w interakcje z GFP w robaku. Jako szczep eksperymentalny użyto OMA-1 oznaczonego GFP, ponieważ wstępne dane sugerują interakcję z DLC-1. Szczepy nicieni wykazujące współekspresję białek kontrolnych i testowych z DLC-1 oznaczonym 3xFLAG są określane w tym tekście jako 3xFLAG::D LC-1; GFP oraz 3xFLAG::D LC-1; OMA-1::GFP (szczepy dostępne na życzenie; więcej informacji w Tabeli Materiałów). W tym przypadku używane są znaczniki 3xFLAG i GFP; jednak inne znaczniki mogą być podstawione, o ile ich przeciwciała są kompatybilne z odczynnikami z zestawu PLA.
1. Opieka nad zwierzętami
- Trzymaj robaki na płytkach pożywki wzrostowej nicieni (NGM), które są wysiane szczepem OP50 E. coli i utrzymuj w temperaturze 24 °C w celu optymalnej ekspresji GFP.
- Dorosłe robaki przechodzą co 2-3 dni, aby rozmnażać robaki i dobrze je odżywić.
2. Przygotowanie hodowli synchronicznej
- Zsynchronizuj robaki, wybielając talerz dobrze odżywionych, grawitacyjnych hermafrodytów. Protokół wybielania jest opisany w Porta-de-la-Riva i wsp. Pozostawić zarodki do wylęgu przez noc w probówce wirówkowej o temperaturze 24 °C, obracając się od końca do końca w 10 ml buforu M9 o minimalnej ilości pożywki (M9). W ten sposób powstanie kultura zatrzymanych larw L1.
- Inkubować probówkę z zatrzymanymi larwami w stadium L1 na lodzie przez 10 minut, a następnie uzupełnić probówkę lodowatym 1x M9.
- Za pomocą wirówki osadzać larwy w temperaturze 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zassać supernatant tak, aby pozostało tylko 1-2 ml supernatantu.
- Zawiesić osad z larwami i za pomocą mikropipety przenieść 2 μl zawieszonych kultur larw na szkiełko podstawowe. Policz, ile larw jest obecnych, aby określić gęstość kultury larw, co pomoże pokierować wysiewem robaków w kroku 2.5.
nuta: Gęstość 10-15 larw L1/1 μl dobrze sprawdza się w siewie.
- Za pomocą mikropipety przenieś objętość kultury larw potrzebną do wysiewu około 100-120 larw w stadium L1 na płytce OP50 o średnicy 60 mm. Na przykład nasiona 10 μl kultury larw o gęstości 10 larw L1/1 μl kultury.
nuta: Nie przekraczaj objętości 40 μl w celu wysiewu larw, w przeciwnym razie nadmiar płynu zakłóci trawnik OP50. Jeśli objętość kultury przekracza 40 μl, powtórz kroki 2.3-2.4, aby jeszcze bardziej zmniejszyć objętość i zwiększyć gęstość hodowli larw.
- Hoduj robaki w temperaturze 24 °C. Zapisuj czas, w którym L1 są wysiewane na talerzu i okresowo sprawdzaj etap rozwoju, aby określić idealny czas na rozbior.
nuta: Po 52 godzinach od wysiewu L1 robaki hodowane w temperaturze 24 °C znajdują się zazwyczaj w stadium młodego dorosłego, które jest idealnym etapem do rozbioru PLA ukierunkowanego na gonady. Jednak rzeczywisty czas, w którym zsynchronizowane robaki osiągają stadium młodego dorosłego osobnika, może się różnić w zależności od szczepu i temperatury inkubacji.
3. Sekcja/ekstruzja gonad
UWAGA: Sekcja w celu wytłoczenia gonady jest konieczna, aby PLA ukierunkowane na gonady działało pomyślnie. Takie podejście może również uwalniać zarodki, które również działają przy użyciu tego protokołu dla PLA (zobacz Dyskusję, aby uzyskać więcej informacji). Po rozbiorze zarówno kontrola ujemna, jak i próbki eksperymentalne są równolegle utrwalane i poddawane obróbce pod kątem PLA. Sugeruje się również, aby przygotować dodatkowy zestaw próbek do celów fluorescencyjnego barwienia koimmunologicznego w celu zademonstrowania wzorców ekspresji partnerów białkowych będących przedmiotem zainteresowania.
- Zbierz 30-40 młodych dorosłych robaków do szklanego naczynia zawierającego 500 μL 1x M9 + lewamizol (końcowe stężenie 2,5 mM). Po zebraniu robaków ostrożnie usuń i wyrzuć większość pożywki, aby usunąć bakterie, które są przenoszone wraz z robakami.
- Dodaj świeże 500 μL 1x M9 + lewamizol i za pomocą pipety delikatnie nabierz i dozuj pożywkę do wypłukania robaków. Ostrożnie usuń i wyrzuć większość pożywki, aby usunąć bakterie, które są przenoszone wraz z robakami.
- Powtórz ten krok 2x-3x, aż wszystkie bakterie zostaną usunięte. Po zakończeniu prania pozostaw robaki w około 100 μl podłoża, aby utrzymać nawodnienie.
nuta: Nie pozwól, aby robaki przebywały w podłożu dłużej niż 7 minut, ponieważ zakłóci to wytłaczanie gonad podczas sekcji. Wykonuj mycie pod pomocą mikroskopu preparacyjnego, aby monitorować usuwanie pożywki, aby robaki nie zostały utracone.
- Za pomocą pipety szklanej lub polietylenowej przenieś ślimaki na szkiełko mikroskopowe o wymiarach 25 mm x 75 mm pokryte 0,001% poli-L-lizyną (szkiełka używane w tej procedurze mają obwód pokryty żywicą epoksydową, pozostawiając trzy obszary robocze o wymiarach 14 mm x 14 mm każde). Usuń nadmiar pożywki tak, aby pozostało około 10-15 μl pożywki.
- Za pomocą mikroskopu preparacyjnego i dwóch igieł o rozmiarze 261/2 umieść jedną igłę na drugiej, tak aby końce utworzyły nożyczki. Używając igieł zorientowanych w ten sposób, odetnij robaki za gardłem, aby uwolnić linie zarodkowe. Wytnij wszystkie robaki w ciągu 5 minut.
nuta: Więcej szczegółów na temat wykonywania sekcji można znaleźć w poprzedniej publikacji Gervaise'a i Arura.
- Po wypreparowaniu wszystkich robaków delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 40 mm na szkiełku tak, aby było prostopadłe do szkiełka. Końce szkiełka nakrywkowego powinny zwisać ze szkiełka.
- Zamrozić szkiełka na wstępnie schłodzonym bloku aluminiowym utrzymywanym na suchym lodzie przez co najmniej 20 minut. Delikatnie umieść schłodzony ołówek na wierzchu szkiełka nakrywkowego, aby zapobiec poluzowaniu się szkiełka nakrywkowego z powodu rozszerzania się lodu.
4. Fiksacja/blokowanie
- Gdy szkiełko nakrywkowe jest gotowe do utrwalenia, strzepnąć je ołówkiem lub innym narzędziem o krawędziach i natychmiast zanurzyć szkiełko w słoiku zawierającym świeży, lodowaty metanol (schłodzony do temperatury -20 °C) na 1 minutę.
- Delikatnie przetrzyj krawędzie szkiełka otaczające próbkę, tak aby następny odczynnik był utrzymywany przez napięcie powierzchniowe wokół próbki. Stosować 150 μl utrwalacza (2% formaldehydu w 100 mM KH2PO4, pH = 7,2) przez 5 minut w temperaturze RT.
nuta: Przetestowaliśmy również procedurę utrwalania metanolu/acetonu i stwierdziliśmy, że jest ona kompatybilna z reakcją PLA.
- Przyłóż szkiełko do ręcznika papierowego pod prostopadłym kątem 90°, aby utrwalacz spłynął ze szkiełka i wchłonął się w ręcznik papierowy. Szkiełka blokowe 2x przez 15 minut w RT w słoiku Coplin z 50 ml 1x PBS/1% albuminy surowicy bydlęcej Triton X-100/1% (PBT/BSA).
nuta: Słoiki z kopeliny lub inne rodzaje słoików do barwienia są zalecane do tego etapu blokowania i poniższych etapów mycia w sekcjach 6-9. Zapewniają one wystarczające objętości do efektywnej wymiany buforu blokującego lub przemłukującego z próbką.
- Szkiełka blokowe z roztworem PBT/BSA zawierającym 10% normalnej surowicy koziej. Delikatnie przetrzyj krawędzie otaczające szkiełko i nałóż 100 μl roztworu na szkiełko. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze.
nuta: Ten etap jest wysoce zalecany do barwienia przeciwciałem pierwszorzędowym αFLAG. Wilgotna komora jest skonstruowana poprzez zabezpieczenie szklanych pipet taśmą w tacy, aby szkiełka mogły się na nich położyć podczas inkubacji. Zwilżone chusteczki zadaniowe (tabela materiałów) są umieszczane w tacy, aby podnieść wewnętrzną wilgotność tacy, aby zapobiec parowaniu. Pokrywka i taca są pokryte folią, aby chronić próbki przed światłem podczas etapów wrażliwych na światło.
- Umieść szkiełko na ręczniku papierowym, aby roztwór PBT/BSA/10%NGS spłynął ze szkiełka i delikatnie przetrzyj krawędzie szkiełka. Użyj odczynnika blokującego (Tabela materiałów), aby zablokować szkiełka. Nałóż jedną kroplę na przestrzeń o wymiarach 14 mm x 14 mm. Inkubować szkiełka podstawowe przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze.
5. Inkubacja przeciwciał pierwotnych
UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki PLA i minimalne tło, współczynnik rozcieńczenia pierwszorzędowych przeciwciał może wymagać optymalizacji (zobacz Dyskusję po więcej szczegółów). Dodatkowo przeciwciała pierwszorzędowe powinny być hodowane w różnych gospodarzach, które odpowiadają specyficzności przeciwciał drugorzędowych stosowanych w PLA.
- Umieść szkiełko na ręczniku papierowym, aby odczynnik blokujący spłynął ze szkiełka i delikatnie wytrzyj krawędzie. Użyj rozcieńczalnika przeciwciał (tabela materiałów), aby rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe. Nałożyć 40 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na przestrzeń 14 mm x 14 mm.
- Szkiełka inkubować w wilgotnej komorze przez noc w temperaturze 4 °C.
6. Inkubacja sondy PLA (przeciwciało wtórne)
UWAGA: Dla kroków 6-9 użyj myjących A i B w RT. Jeśli są przechowywane w temperaturze 4 °C, przed użyciem pozwól im ogrzać się do temperatury pokojowej.
- Myj szkiełka 2x przez 5 minut z 50 ml 1x buforu do płukania A (tabela materiałów) w temperaturze pokojowej w słoiku Coplin. Ustaw słoik Coplin na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 60 obr./min.
- Umieść szkiełko na ręczniku papierowym, aby bufor do mycia spłynął ze szkiełka i delikatnie wytrzyj krawędzie. Przygotować 40 μl roztworu zawierającego sondy PLUS i MINUS (rozcieńczonego w stosunku 1:5 rozcieńczalnikiem przeciwciał). Nanieść roztwór na każdą przestrzeń o wymiarach 14 mm x 14 mm.
- Szkiełka inkubować w wilgotnej komorze przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
7. Podwiązanie
- Myj szkiełka 2x przez 5 minut z 50 ml 1x buforu do płukania A w RT w słoiku Coplin. Ustaw słoik Coplin na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 60 obr./min.
- Rozcieńczyć bufor do ligacji (tabela materiałów) w stosunku 1:5 ultraczystą wodą. Użyć tego buforu do rozcieńczenia ligazy (tabela materiałów) w stosunku 1:40 w celu przygotowania roboczego roztworu do ligacji.
- Umieść szkiełko na ręczniku papierowym, aby bufor do mycia spłynął ze szkiełka i delikatnie wytrzyj krawędzie. Nanieść 40 μl roztworu do ligacji na każdą przestrzeń o wymiarach 14 mm x 14 mm.
- Inkubować szkiełka podstawowe w wilgotnej komorze przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
8. Wzmocnienie
UWAGA: Użycie odczynników detekcyjnych z czerwonymi fluoroforami (Tabela materiałów) skutkuje najmniejszą ilością tła w tkance C. elegans.
- Myj szkiełka 2x przez 5 minut z 50 ml 1x buforu do płukania A w RT w słoiku Coplin. Ustaw słoik Coplin na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 60 obr./min.
- Rozcieńczyć czerwony bufor wzmacniający (tabela materiałów) w stosunku 1:5 ultraczystą wodą. Użyj tego buforu do rozcieńczenia polimerazy (tabela materiałów) w stosunku 1:80, aby przygotować zapas roboczy roztworu wzmacniającego i chronić przed światłem.
- Umieść szkiełko na ręczniku papierowym, aby bufor do mycia spłynął ze szkiełka i delikatnie wytrzyj krawędzie. Nanieść 40 μl roztworu wzmacniającego na każdą przestrzeń o wymiarach 14 mm x 14 mm.
- Szkiełka inkubować w wilgotnej komorze przez 1 godzinę i 40 minut w temperaturze 37 °C. Upewnij się, że wilgotna komora jest przykryta folią w celu ochrony próbek przed światłem.
9. Końcowe pranie
- Myj szkiełka 2x przez 10 minut z 50 ml 1x buforu do płukania B (tabela materiałów) w temperaturze RT w słoiku Coplin. Ustaw słoik Coplin na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 60 obr./min.
- Myj szkiełka 1x przez 1 minutę z 50 ml 0,01x buforu do płukania B w temperaturze RT w słoiku Coplin. Ustaw słoik Coplin na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 60 obr./min. Bufor ten przygotowuje się przez rozcieńczenie buforu B do przemywania ultraczystą wodą.
10. Montaż szkiełek nakrywkowych
- Pozwól, aby nadmiar buforu do płukania spłynął ze szkiełka na ręcznik papierowy i zetrzyj wszelkie pozostałości buforu pozostające na obwodzie szkiełka pokrytym żywicą epoksydową.
- Dodać 10 μl podłoża wzorcowego (tabela materiałów) do próbki i delikatnie położyć szkiełko nakrywkowe na wierzchu, pozwalając na rozprowadzenie podłoża mocującego.
- Pomaluj krawędź szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe i szkiełko. Delikatnie nakładaj lakier do paznokci, aby uniknąć przesuwania szkiełka nakrywkowego, co spowoduje uszkodzenie linii zarodkowych. Pozwól lakierowi do paznokci stwardnieć przez co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej, podczas gdy szkiełka są chronione przed światłem, przed obejrzeniem go pod mikroskopem.
