Trawienie białek na błonie w celu przygotowania białek współimmunoprecypitowanych do badań interakcji

Streszczenie

Źródło: Obama, T. et al., Ocena interakcji białko-białko przy użyciu techniki trawienia na błonie.J. Vis. Exp.(2019 rok)

Ten film demonstruje koimmunoprecypitowane kompleksy białkowe na membranie PVDF do analizy interakcji białko-białko. Zredukowane białka z kompleksów potraktowano trypsyną w celu rozszczepienia poszczególnych białek na mniejsze peptydy, a następnie pozostałe peptydy wyekstrahowano z błony PVDF. Wyciągnięty peptyd pochodzący z obu białek w kompleksie został następnie wysuszony i ponownie zawieszony w niskim stężeniu kwasu mrówkowego w celu dalszej analizy.

Protokół

1. Immunoprecypitacja

UWAGA: Użyliśmy buforu do lizy bez dodecylosiarczanu sodu (SDS) i elucji cytrynianu, jak opisano w poniższych sekcjach. Jednak zastosowanie alternatywnej techniki immunoprecypitacji we własnym zakresie może być również stosowane do przygotowania próbek LC-MS/MS.

1. Transfekcja komórek hodowlanych z wektorami kodującymi sam znacznik epitopu lub białko fuzyjne. Aby uzyskać reprezentatywne dane, przenieś komórki J774 (1 x 10⁶) z wektorami kodującymi samo białko zielonej fluorescencji (GFP) lub Capn6 (gen kalpainy-6) z fuzją GFP za pomocą liposomów kationowych.
2. Sprzężone przec....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Acetonitrylu	Wako	Numer katalogowy: 014-00386
Kwas cytrynowy	Wako	Numer katalogowy: 030-05525
Naziemna telewizja	Teski Nacalai	Numer katalogowy 14112-94
Dynabeads białko G	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy 10003D
kwas mrówkowy	Wako	Numer katalogowy: 066-00461
Jodoacetamid	Wako	Numer katalogowy: 095-02151
Lipofektamina 3000	Thermo Fisher Naukowy	L3000008
Żywe kolory A.v. Przeciwciało monoklonalne (JL-8)	Clontech	Numer katalogowy: 632380
Zawartość NaCl	Wako	Numer katalogowy: 191-01665
NH4HCO3	Wako	Numer katalogowy: 018-21742
Nonidet P-40	Sigma	Nr kat. N6507	Eter poli(oksyeteleno)oktylofenylowy (n=9)
Koktajl inhibitorów proteazy	Sigma	Zobacz materiał P8465
Zmodyfikowana trypsyna klasy sekwencjonowania	Preparat Promega	V5111	trypsyna
Ortowanadan sodu	Sigma	Zobacz materiał S6508
Sód fosforan dwuzasadowy dwuwodny	Sigma	71643
Umowa o zachowaniu poufności	Wako	206-10731
Tris	Wako	207-06275
Tween-20 (Kanał Telewizyjny)	Wako	160-21211

cyfrowa powiedział: powiedział: powiedział: