1. Immunoprecypitacja
UWAGA: Użyliśmy buforu do lizy bez dodecylosiarczanu sodu (SDS) i elucji cytrynianu, jak opisano w poniższych sekcjach. Jednak zastosowanie alternatywnej techniki immunoprecypitacji we własnym zakresie może być również stosowane do przygotowania próbek LC-MS/MS.
- Transfekcja komórek hodowlanych z wektorami kodującymi sam znacznik epitopu lub białko fuzyjne. Aby uzyskać reprezentatywne dane, przenieś komórki J774 (1 x 106) z wektorami kodującymi samo białko zielonej fluorescencji (GFP) lub Capn6 (gen kalpainy-6) z fuzją GFP za pomocą liposomów kationowych.
- Sprzężone przeciwciało z kulkami magnetycznymi.
- W tym celu należy zmieszać przeciwciało anty-GFP (2 μL/reakcję) z kulkami magnetycznymi (25 μL/reakcję) w 500 μL buforu fosforanu cytrynianu (24,5 mM kwasu cytrynowego, 51,7 mM dwuzasadowego fosforanu sodu; pH 5,0) w probówce o pojemności 1,5 ml.
- Obracaj mieszaninę z prędkością 50 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie trzykrotnie przemyć kulki sprzężone z IgG buforem fosforanowo-cytrynianowym zawierającym 0,1% monolaurynianu polioksyetylenosorbitolu (20).
- Poddać lizie transfekowane komórki przy użyciu odpowiedniego buforu do lizy. W celu uzyskania reprezentatywnych danych poddać transfekowane komórki lizie przez 30 minut na lodzie w 400 μl buforu do lizy (50 mM Tris-HCl; pH 7,5, 120 mM NaCl, 0,5% eteru poli(oksyetelenowego) oktylofenylowego) zawierającego 40 μmol/l fluorku fenylometylosulfonylu, 50 μg/ml leupeptyny, 50 μg/ml aprotyniny, 200 μmol/l ortowanadanu sodu, i 1 mM kwasu tetraoctowego glikolu etylenowego (EGTA) w probówkach o pojemności 1,5 ml 24 godziny po transfekcji.
- Oczyścić lizat przez odwirowanie przy 15 000 x g przez 5 minut i zebrać supernatant.
- Wstępnie oczyścić lizat. Dodaj nieoznakowane kulki magnetyczne (25 μl/reakcję) do probówki o pojemności 1,5 ml. Przemyć kulki trzykrotnie 500 μl buforu fosforanowo-cytrynianowego. Po usunięciu buforu fosforanu cytrynianu w końcowym płukaniu, dodaj lizat komórkowy na kulki magnetyczne. Obracaj mieszaninę za pomocą rotatora z prędkością 50 obr./min przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 5 minut w celu separacji magnetycznej i zbierz lizat komórkowy. Zaleca się stosowanie stojaka magnetycznego wyznaczonego przez producenta.
- Zwiąż docelowe białka ze sprzężonymi kulkami. Umieść kulki sprzężone z immunoglobuliną (Ig)G na stojaku magnetycznym na 5 minut w celu separacji magnetycznej, wyrzuć bufor cytrynianu, a następnie dodaj lizat komórkowy do oddzielonych kulek.
- Obracaj mieszaninę z prędkością 50 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Oddzielić białka docelowe od wolnych białek niebędących celem. Przemyć kulki trzykrotnie za pomocą 500 μl buforu fosforanowo-cytrynianowego zawierającego 0,1% monolaurynianu polioksyetylenosorbitolu (20). Po ostatnim płukaniu dodać 30 μl buforu cytrynianowego (pH 2-3) i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu wymycia docelowych białek.
nuta: Jeśli rekonwalescencja po immunoprecypitacji jest niewystarczająca, zastosowanie alternatywnych znaczników epitopów, takich jak FLAG lub HIS, może poprawić skuteczność. Jeżeli skuteczność elucji jest niewystarczająca, zastosowanie innych eluantów, takich jak roztwór na bazie karty charakterystyki, może poprawić wydajność.
2. Trawienie białek na błonie
UWAGA: Używanie materiałów i urządzeń bez białka jest konieczne, aby uniknąć zanieczyszczenia białkami egzogennymi. Ponadto zaleca się, aby operator nosił maskę chirurgiczną i rękawice, aby uniknąć zanieczyszczenia ludzkimi białkami.
- Pokrój membrany PVDF na kawałki o wymiarach 3 mm x 3 mm za pomocą nożyczek chirurgicznych, które zostały przetarte metanolem i wysuszone bezpośrednio przed użyciem.
- Dodaj 2–5 μl etanolu do kawałków membrany PVDF na czystej folii aluminiowej.
- Przed całkowitym wyschnięciem dodaj eluant (po 2–5 μl, 4–6 sztuk na próbkę) na hydrofilowe membrany PVDF, a następnie wysusz membrany na powietrzu, aż powierzchnia membrany stanie się matowa. Wysuszone membrany można przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Przenieś wszystkie membrany do plastikowych probówek o pojemności 1,5 ml, dodaj 20–30 μl etanolu, aby membrany stały się hydrofilowe, a następnie usuń etanol za pomocą pipety.
- Zanim membrana całkowicie wyschnie, dodać 200 μl roztworu reakcyjnego na bazie ditiotreitolu (DTT) (80 mM NH4HCO3, 10 mM DTT i 20% acetonitrylu) i inkubować w temperaturze 56 °C przez 1 godzinę.
- Zastąp roztwór reakcyjny 300 μl roztworu jodoacetamidu (80 mM NH4HCO3, 55 mM jodoacetamidu i 20% acetonitrylu) i inkubuj przez 45 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
- Przemyć membrany dwukrotnie 1 ml wody destylowanej i raz 1 ml 2% acetonitrylu przez mieszanie wirowe przez >10 s.
- Rozpuścić liofilizowaną trypsynę klasy MS (tabela materiałów) bezpośrednio w roztworze reakcyjnym (30 mM NH4HCO3 zawierającym 70% acetonitrylu). Dodać 100 μl roztworu reakcyjnego zawierającego 1 μg trypsyny (tabela materiałów) (30 mM NH4HCO3 zawierającego 70% acetonitrylu) i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
- Przenieść roztwór reakcyjny zawierający trawienie tryptyczne do czystej probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety.
- Dodać 100 μl roztworu do przemywania (70% acetonitrylu/1% kwasu trifluorooctowego) do membrany i inkubować w temperaturze 60 °C przez 2 godziny. Zebrać roztwór do przemywania i wymieszać go z roztworem reakcyjnym. Dodaj kolejne 100 μl roztworu myjącego do membrany i poddaj ją sonikacji przez 10 minut. Następnie zebrać roztwór do płukania i wymieszać go z roztworem reakcyjnym.
- Przykryj probówkę kawałkiem folii laboratoryjnej i wykonaj kilka małych otworów igłą. Wysuszyć roztwór za pomocą koncentratora próżniowego.
- Pozostałość rozpuścić w 10 μl 0,2% kwasu mrówkowego. Po odwirowaniu (12 000 × g, 3 min w temperaturze pokojowej) przenieść supernatant do probówki z próbką.
nuta: Mycie jest krytycznym etapem tej sekcji. Podczas trawienia białek na błonie, płukanie błon zawierających unieruchomione białka po redukcji i alkilacji wodą destylowaną, a następnie 2% acetonitrylem, przez ponad 10 sekund każde, ma kluczowe znaczenie dla usunięcia odczynników.
