$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Konfiguracja nawodnienia i testu biosensora
- Włącz maszynę BLItz.
- Upewnij się, że urządzenie jest podłączone do komputera przez port wyjściowy USB z tyłu urządzenia.
- Na komputerze otwórz powiązane oprogramowanie (np. BLItz Pro) i kliknij Advanced Kinetics po lewej stronie ekranu.
- W oprogramowaniu wpisz wszystkie odpowiednie informacje o eksperymencie (w tym nazwę eksperymentu, opis, identyfikator próbki i stężenie białka) pod każdym odpowiednim nagłówkiem.
- Kliknij Typ bioczujnika i wybierz Ni-NTA z menu rozwijanego.
- Pod nagłówkiem Ustawienia uruchamiania sprawdź, czy wytrząsarka jest ustawiona na wartość Włącz.
- Pod nagłówkiem Lista typów kroków sprawdź, czy na liście znajduje się 5 elementów: Początkowy plan bazowy, Ładowanie, Plan bazowy, Skojarzenie i Dysocjacja.
nuta: Czas trwania każdego kroku można w razie potrzeby zmienić z domyślnego. Aby uzyskać optymalne wyniki, użyj co najmniej 30 s dla początkowej linii bazowej i linii bazowej; i 120 s dla asocjacji i dysocjacji. Czas trwania etapu ładowania (w zakresie od 120 do 240 s) będzie zależał od stężenia liganda i powinowactwa znacznika epitopu Hisa na ligandzie do biosensora Ni-NTA.
- Wyjmij uwodniony bioczujnik Ni-NTA z probówki do PCR i przymocuj go do uchwytu biosensora na maszynie, wsuwając szeroką część biosensora na uchwyt.
nuta: Nie pozwól, aby bioczujnik wyschł podczas eksperymentu.
- Umieść czarną probówkę do mikrowirówki o pojemności 0,5 ml w uchwycie probówki urządzenia i odpipetuj do niej 400 μl buforu BLI.
- Sprawdź, czy suwak maszyny jest ustawiony w taki sposób, aby uchwyt rurki znajdował się przed czarną strzałką na maszynie.
- Zamknij pokrywę maszyny tak, aby końcówka biosensora zanurzyła się w buforze w probówce mikrowirówki.
- Kliknij przycisk Dalej w oprogramowaniu, aby rozpocząć nagrywanie początkowej linii bazowej.
2. Ładowanie liganda do biosensora
- Po zakończeniu nagrywania kroku Początkowa linia bazowa otwórz pokrywę urządzenia.
- Przesuń suwak w prawo tak, aby uchwyt kropli (zamiast uchwytu probówki) znajdował się przed czarną strzałką.
- Odpipetować 4 μl dializowanego liganda znakowanego His na uchwyt kropli i zamknąć pokrywę urządzenia.
UWAGA: Optymalne stężenie liganda, który ma być użyty, może się różnić dla każdego białka. Stężenie od 1,0 do 2,0 mg/ml jest zwykle wystarczające do nasycenia NTA na końcówce biosensora w ciągu 240 s.
- W oprogramowaniu kliknij przycisk Dalej, aby rozpocząć ładowanie.
3. Wymywanie dodatkowego ligandu
- Po zakończeniu nagrywania w kroku ładowania otwórz pokrywę urządzenia.
- Przesuń suwak w lewo tak, aby uchwyt rurki ponownie znalazł się przed czarną strzałką.
- Zamknij pokrywę urządzenia i upewnij się, że końcówka biosensora jest zanurzona w buforze BLI rurki w uchwycie probówki.
- Kliknij ponownie przycisk Dalej w oprogramowaniu, aby rozpocząć nagrywanie linii bazowej.
4. Związek analitu z ligandem
- Po zakończeniu nagrywania kroku Linia bazowa otwórz pokrywę urządzenia.
- Wyjmij uchwyt na krople i wyczyść go, odpipetowując białka i spłukując wodą podwójnie dejonizowaną (ddH2O) w sumie 5 razy.
- Użyj chusteczki higienicznej, aby wyczyścić powierzchnię uchwytu na krople po umyciu.
- Załóż uchwyt kropli z powrotem na maszynę.
- Przesuń suwak na maszynie w prawo, tak aby uchwyt kropli ponownie znalazł się przed czarną strzałką.
- Pobrać pipetę 4 μl dializowanego analitu na uchwyt kropli i zamknąć pokrywę urządzenia.
- W oprogramowaniu kliknij przycisk Dalej, aby rozpocząć asocjację.
5. Dysocjacja analitu od liganda
- Po zakończeniu nagrywania w kroku Skojarzenie otwórz pokrywę urządzenia.
- Przesuń suwak na maszynie w prawo, tak aby uchwyt rurki ponownie znalazł się przed czarną strzałką.
- W oprogramowaniu kliknij przycisk Dalej, aby rozpocząć dysocjację.
- Po zakończeniu nagrywania w kroku Dysocjacja otwórz pokrywę urządzenia.
- Wyjmij uchwyt kropli i uchwyt probówki.
- Dokładnie spłucz oba ddH2O, aby zmyć wszelkie białka.
- Wyjmij bioczujnik i wyrzuć go w bezpieczny sposób.