$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie próbki: Test mieszania komórek z komórkami
UWAGA: Poniższy protokół opisuje procedurę mieszania dla przylegających komórek. Może być on modyfikowany dla komórek hodowanych w zawiesinie.
- Wysiewać odpowiednią liczbę komórek na płytce 6-dołkowej, np. 800 000 komórek HEK 293T (policzonych za pomocą komory liczącej Neubauera), dzień przed transfekcją. Liczba ta może być modyfikowana w zależności od czasu między wysiewem a transfekcją i dostosowywana do innych typów komórek. Aby przeprowadzić podstawowy eksperyment (tj. białka będące przedmiotem zainteresowania i kontrola negatywna), przygotuj co najmniej 4 studzienki. Hodowla komórek w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w pożywce Modified Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełniona płodową surowicą bydlęcą (10%) i L-glutaminą (1%).
- Ogniwa transfekcyjne należy wykonywać zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela Materiałów).
- Aby przeprowadzić podstawowy eksperyment, należy przetransfekować, w oddzielnych studzienkach, plazmidy dla interesującego nas białka połączonego z "zielonym" (np. monomerycznym wzmocnionym zielonym białkiem fluorescencyjnym (mEGFP) lub żółtym białkiem fluorescencyjnym (mEYFP)) lub "czerwonym" (np. mCherry lub mCardinal) białkiem fluorescencyjnym.
nuta: W tym protokole skupiamy się na APLP1-mEYFP i APLP1-mCardinal oraz odpowiedniej kontroli negatywnej, np. myrystoilowany-palmitoilowany-mEYFP (myr-palm-mEYFP) i -mCardinal (myr-palm-mCardinal). Generalnie wystarczy 200 ng - 1 μg plazmidowego DNA. Wysoka wydajność transfekcji zwiększa szansę na znalezienie "czerwonych" i "zielonych" komórek w kontakcie. Zmodyfikuj ilość plazmidu i odczynnika do transfekcji, aby zoptymalizować wydajność transfekcji. krytyczny: Zbieżność komórek powinna wynosić około 70% podczas transfekcji komórek. Jeśli komórki są nadmiernie zlewające się, wydajność transfekcji zmniejszy się. Jeśli komórki nie są wystarczająco zlewne, transfekcja i mieszanie mogą wywoływać stres i uniemożliwiać wielu komórkom prawidłowe przyczepienie się po wymieszaniu.
- Wykonaj mieszanie komórek ~4 ± 2 godziny po transfekcji.
- Usunąć pożywkę wzrostową i delikatnie umyć każde z nich 1 ml PBS uzupełnionym Mg2+ i Ca2+. Następnie usuń PBS. (Krytyczny) Upuść PBS na krawędź studzienki, aby zapobiec oderwaniu się komórek podczas mycia.
- Dodaj kroplami ~ 50 μl roztworu kwasu trypsyny etylenodiaminotetraoctowej (EDTA) do każdej studzienki, aby ułatwić oderwanie komórek. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 minuty. Następnie powoli potrząśnij bocznie płytką 6-dołkową, aby odłączyć komórki.
nuta: W przypadku niektórych typów komórek może być wymagane wydłużenie czasu inkubacji.
- Dodać 950 μl pożywki wzrostowej do każdej studzienki i ponownie zawiesić komórki, pipetując kilka razy w górę i w dół, odłączając w ten sposób wszystkie komórki od dna studzienki. (Krytyczny) Upewnij się, że komórki są prawidłowo zawieszone i odłączone od siebie, sprawdzając wzrokowo, czy po ponownym zawieszeniu nie ma dużych agregatów komórek. W przeciwnym razie po zmieszaniu uzyska się wiele styków "czerwony"-"czerwony" lub "zielony"-"zielony".
- Przenieś roztwór komórkowy jednego dołka (białka będącego przedmiotem zainteresowania lub kontroli ujemnej) do odpowiedniego dołka, tj. "czerwonego" (np. transfekowanego APLP1-mCardinal) do "zielonych" (np. transfekowanych APLP1-mEYFP) komórek. Wymieszaj, delikatnie pipetując kilka razy w górę i w dół. Następnie wysiewaj zmieszane komórki na 35-milimetrowych szklanych szalkach (1 ml roztworu mieszanych komórek na szalkę plus 1 ml pożywki wzrostowej) i hoduj komórki wysiewane przez kolejny dzień w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
2. Przygotowanie próbki: kontrola pozytywna do eksperymentów z korelacją krzyżową i konstrukt homo-dimerów do analizy jasności
- Wysiewać 600 000 komórek HEK 293T, policzonych za pomocą komory do liczenia komórek, na szalkach ze szklanym dnem o średnicy 35 mm na dzień przed transfekcją. Hodować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w kompletnym pożywce DMEM (patrz krok 1.1) przez kolejny dzień.
- Komórki transfekcyjne z ~250 ng plazmidowego DNA zgodnie z instrukcjami producenta. Do kontroli dodatniej korelacji krzyżowej należy użyć plazmidu kodującego heterodimer białka fluorescencyjnego zakotwiczonego w błonie, np. myr-palm-mCherry-mEGFP lub myr-palm-mCardinal-mEYFP odpowiadającego FP białka będącego przedmiotem zainteresowania. Do kalibracji jasności należy użyć plazmidów kodujących zarówno monomer FP zakotwiczony w błonie, jak i homo-dimer odpowiadający FP połączonym z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania, np. myr-palm-mEYFP i myr-palm-mEYFP-mEYFP, aby skalibrować analizę jasności APLP1-mEYFP.
- Hodowla komórek w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w kompletnym pożywce DMEM (patrz krok 1.1) przez kolejny dzień.
3. Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa: konfiguracja i kalibracja objętości ogniskowej
UWAGA: Poniższy protokół jest napisany dla eksperymentów przeprowadzanych za pomocą mEGFP/mEYFP i mCherry/mCardinal na laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym używanym w tym badaniu. Konfiguracja optyczna, ustawienia oprogramowania (linie laserowe, lustra dichroiczne, filtry) oraz wybór barwników kalibracyjnych mogą być modyfikowane dla innych konfiguracji FP i mikroskopów.
- Włącz mikroskop i lasery co najmniej godzinę przed eksperymentem, aby zapewnić stabilność lasera i równowagę temperatury.
- Przygotuj 100-200 μl odpowiednich rozpuszczalnych w wodzie roztworów barwników fluorescencyjnych (przykłady znajdują się w Tabeli materiałów) w wodzie lub PBS, aby skalibrować objętość ogniskowej o stężeniach w zakresie 10-50 nM.
- Umieść roztwory barwnika na czystym naczyniu ze szklanym dnem o średnicy 35 mm #1.5, tj. o grubości 0.16-0.19 mm.
nuta: Najlepiej używać naczyń z wysokowydajnym szkłem nakrywkowym o niskiej tolerancji grubości, np. 0,170 ± 0,005 mm, co pozwala na optymalną korekcję pierścienia kołnierza (krok 3.6). Ważne jest, aby użyć tego samego rodzaju dania, które zostało użyte później w poniższych eksperymentach.
- Umieść naczynie zawierające roztwór barwnika bezpośrednio na obiektywie (najlepiej zanurzenie w wodzie, z NA 1.2), aby zapewnić skupienie w roztworze. Alternatywnie, umieść naczynie na uchwycie próbki i skup się na próbce (np. 10-20 μm powyżej dna naczynia).
UWAGA: Nie zalecamy używania obiektywów olejowych ze względu na słaby sygnał uzyskiwany podczas ustawiania ostrości głęboko w próbkach wodnych.
- Ustaw ścieżkę wzbudzenia i emisji, np. wybierz laser 488 nm, zwierciadło dichroiczne 488/561 nm, okno detekcji 499-552 nm i rozmiar otworka 1 jednostka Airy'ego (AU). Upewnij się, że rozmiar otworka jest taki sam, jak ten, który będzie używany w pomiarach korelacji krzyżowej.
- Wyreguluj pozycję otworka (regulacja otworka) i pierścień kołnierza obiektywu, aby zmaksymalizować szybkość zliczania. W tym celu obracaj pierścień kołnierza, aż zostanie wykryta maksymalna szybkość zliczania.
nuta: Korekcja pierścienia kołnierza uwzględnia określoną grubość zastosowanego szkła nakrywkowego. Maksymalizacja szybkości zliczania, tj. zebranie jak największej liczby fotonów na cząsteczkę, ma kluczowe znaczenie dla maksymalizacji stosunku sygnału do szumu (SNR) pomiarów.
- Wykonać serię punktowych pomiarów FCS (np. 6 pomiarów w różnych lokalizacjach, z których każdy składa się z 15 powtórzeń po 10 s, tj. 2,5 minuty całkowitego czasu, próbkowanych z czasem przebywania 1 μs lub mniejszym) przy tej samej mocy lasera, jaka jest stosowana w pomiarach korelacji krzyżowej (zwykle ~1%, tj. ~1-2 μW).
- Dopasuj trójwymiarowy model dyfuzji z udziałem trypletów (równanie 1) do danych.
nuta: Zazwyczaj uzyskiwane czasy dyfuzji wynoszą około 30 μs, a współczynnik struktury wynosi około 4-8.
- Obliczyć obwód w0 na podstawie zmierzonego średniego czasu dyfuzji i opublikowanych wartości współczynnika dyfuzji użytego barwnika w temperaturze pokojowej zgodnie z równaniem 2.
Typowe wartości to 200-250 nm.
- W razie potrzeby powtórzyć procedurę kalibracji (kroki 3.4-3.9) z innym barwnikiem fluorescencyjnym dla drugiego kanału detekcji (np. wzbudzenie 561 nm i detekcja między 570 nm a 695 nm). Zachowaj pozycję i rozmiar otworka tak, jak został ustawiony dla pierwszego kanału detekcji.
- Oblicz jasność molekularną (równanie 3) na podstawie pomiarów kalibracyjnych i zapisz uzyskane wartości.
nuta: Typowe wartości dla zastosowanego układu to ~8-10 kHz/cząsteczkę (MOL) dla mocy wzbudzenia 1,8 μW 488 nm. Niższe niż zwykle wartości mogą wskazywać na zabrudzenie obiektywu, niewspółosiowość konfiguracji lub zmniejszoną moc lasera. Regularnie sprawdzaj i przechowuj moc wyjściową lasera na obiektywie za pomocą miernika mocy. Dla porównania różnych konfiguracji, jasność molekularna znormalizowana przez moc lasera wzbudzenia jest najbardziej znaczącym parametrem do oceny wydajności mikroskopu.
4. Spektroskopia fluorescencji skaningowej: Akwizycja
UWAGA: Poniższy protokół jest napisany dla eksperymentów przeprowadzanych z mEGFP/mEYFP ('zielony') i mCherry/mCardinal ('czerwony') na laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym używanym w tym badaniu. Konfiguracja optyczna i ustawienia oprogramowania (linie laserowe, lustra dichroiczne, filtry) mogą się różnić w przypadku innych FP lub ustawień mikroskopu.
- Ustaw tor optyczny, np. wzbudzenie 488 nm i 561 nm oraz zwierciadło dichroiczne 488/561 nm, otworek na 1 AU dla wzbudzenia 488 nm. Aby uniknąć przesłuchów spektralnych, wybierz dwie oddzielne ścieżki do wzbudzania i wykrywania mEGFP/mEYFP (wzbudzenie 488 nm, kanał zielony) i mCherry/ mCardinal (wzbudzenie 561 nm, kanał czerwony) sekwencyjnie i wybierz ścieżki przełączania każdej linii. Do detekcji należy użyć odpowiednich filtrów dla obu kanałów, np. 499-552 nm w kanale zielonym i 570-695 nm w kanale czerwonym.
- Jeśli wzbudzenie naprzemienne nie jest możliwe, należy zastosować odpowiednie ustawienia filtra dla kanału czerwonego, aby zminimalizować przesłuchy widmowe (tj. wykryć fluorescencję mCherry/mCardinal nie poniżej 600 nm). Może to zmniejszyć ilość fotonów wykrywanych w kanale czerwonym, a tym samym zmniejszyć SNR.
- Umieścić naczynie zawierające wymieszane komórki na uchwycie na próbkę. Odczekaj co najmniej 10 minut, aby zapewnić równowagę temperatury i zmniejszyć dryft ostrości.
- Skoncentruj się na komórkach za pomocą lampki transmisyjnej w menu Zlokalizuj.
- Wyszukaj parę "czerwonych" i "zielonych" komórek, które stykają się ze sobą. W celu uzyskania dodatniej korelacji krzyżowej lub kontroli jasności homo-dimerów (patrz sekcja 2), należy poszukać izolowanej komórki emitującej fluorescencję w obu kanałach lub odpowiedniego sygnału homo-dimeru w PM.
UWAGA: (Krytyczne) Zminimalizuj ekspozycję próbki podczas poszukiwania komórek, aby uniknąć wstępnego wybielania, co może zmniejszyć korelację krzyżową. Dlatego skanuj z największą prędkością skanowania i przy niskich mocach lasera. Aby uniknąć nasycenia detektora podczas obrazowania komórek o silnej ekspresji, szukaj w trybie integracji. Jednak, aby zminimalizować ekspozycję, skanowanie przy niższych mocach lasera jest możliwe w trybie zliczania fotonów.
- Wybierz ścieżkę skanowania prostopadłą do kontaktu komórka-komórka (lub do PM pojedynczej komórki w celu dodatniej korelacji krzyżowej lub kontroli jasności homo-dimerów) za pomocą przycisku Przytnij, jak pokazano na rysunkach 1B i 2A.
nuta: Niektóre starsze mikroskopy nie pozwalają na dowolne kierunki skanowania. W takim przypadku należy zlokalizować kontakty komórka-komórka o orientacji prostopadłej do kierunku skanowania.
- Powiększ, aby uzyskać rozmiar piksela 50-200 nm i wybierz Linia w trybie skanowania. Ustaw rozmiar klatki na 128 × 1 pikseli.
nuta: Typowy rozmiar piksela to 160 nm, co odpowiada długości skanowania około 20 μm.
- Ustaw prędkość skanowania na maksymalną dozwoloną wartość, np. 472,73 μs na linię.
nuta: W przypadku alternatywnego schematu wzbudzenia odpowiada to czasowi skanowania 954,45 μs, tj. ~1000 skanów/s w zastosowanym układzie. Szybkość skanowania można dostosować w zależności od współczynnika dyfuzji białka będącego przedmiotem zainteresowania. W przypadku białek zakotwiczonych w błonie typowe czasy dyfuzji wynoszą około 10-20 ms. Czas skanowania powinien być co najmniej dziesięciokrotnie krótszy niż czas dyfuzji. Niższe prędkości skanowania mogą powodować silniejsze fotowybielanie i wymagać mniejszej mocy oświetlenia. Alternatywnie można nałożyć pauzę, np. 5 ms, pomiędzy każdym skanowaniem dla bardzo wolno dyfuzyjnych kompleksów za pomocą Interwału w podmenu Szeregi czasowe.
- Dobierz odpowiednie moce lasera, np. ~1-2 μW dla 488 nm i ~5-10 μW dla wzbudzenia 561 nm.
nuta: Wyższe moce lasera poprawiają SNR, ale zwiększają fotowybielanie. Dlatego moce lasera powinny być tak dobrane, aby fotowybielanie było mniejsze niż 50% początkowej szybkości zliczania.
- Ustaw cykle na 100 000-500 000,
nuta: Liczba skanów, tj. czas trwania pomiaru, może się różnić: Dłuższe czasy pomiaru poprawią SNR i mogą być bardziej odpowiednie dla wolno dyfuzyjnych cząsteczek, jednak ruch komórek i fotowybielanie ograniczają maksymalny czas pomiaru. Prezentowane tutaj dane były rutynowo pozyskiwane przez ~3-6 minut, czyli 200 000-400 000 skanów linii.
- Ustaw detektory w trybie zliczania fotonów. Naciśnij przycisk Rozpocznij eksperyment, aby rozpocząć pobieranie. Powtórz kroki 4.5-4.11, aby zmierzyć inną komórkę.
nuta: Zaleca się pomiar 10-15 komórek na próbkę na różnych poziomach ekspresji. (Krytyczny) Unikaj nasycenia detektora przy wysokich poziomach ekspresji. Maksymalna szybkość zliczania nie powinna przekraczać ~1 MHz.
- Jeżeli analiza jasności jest przeprowadzana w celu określenia stanów oligomerycznych, należy wykonać pomiary kalibracji jasności homo-dimerów zgodnie ze zmodyfikowanymi krokami 4.1-4.11: Zmierzyć każdy homo-dimer białka fluorescencyjnego osobno (w izolowanych komórkach, przygotowanych z wykorzystaniem sekcji 2 protokołu) i wykonywać pomiary tylko w jednym kanale widmowym.
