Test immunoprecypitacyjny do badania interakcji receptorów enzymatycznych w transfekowanych komórkach

Streszczenie

Źródło: Strazza, M., et al. Test koimmunoprecypitacji do badania funkcjonalnych interakcji między receptorami i enzymami. J. Vis. Exp. (2018).

W tym filmie demonstrujemy technikę przeprowadzania ko-immunoprecypitacji oznaczonych przez GFP dzikich i zmutowanych białek PD-1 za pomocą koralików pokrytych przeciwciałami anty-GFP. Białka PD-1-GFP związane z kulkami są inkubowane z białkami SHP2, które oddziałują z PD-1, umożliwiając identyfikację określonych motywów strukturalnych w PD-1, które odgrywają kluczową rolę w interakcji SHP2.

Protokół

1. Immunoprecypitacja

UWAGA: Następujące kroki powinny być wykonywane na lodzie lub w temperaturze 4 °C.

1. Uzupełnij bufor do lizy (50 mM Tris-HCl o pH 7,2, 250 mM NaCl, 0,1% NP-40, 2 mM EDTA, 10% glicerolu) inhibitorami proteazy (rozpuścić 1 tabletkę w 10 ml buforu do lizy) i 1 mM orthovanadatem sodu. Dodać 500 μl lodowatego buforu do lizy do komórek i natychmiast usunąć i zebrać komórki z płytek za pomocą skrobaka do komórek.
   nuta: Ważne jest, aby dodać ortowananian sodu tylko do buforu do lizy, który będzie używany do płytek transfekowanych PD-1-GFP, ponieważ płytki transfekowane SHP2 i nietransfekowane płytki kontrolne muszą zachowywać aktywność fosfatazy.
2. Przenieść lizaty do zimnych probówek o pojemności 1,5 ml i obracać je w temperaturze 0,005 x g, 4 °C przez 30 minut.
3. Aby zebrać supernatant postjądrowy (PNS) z lizatów, należy wirować lizaty przez 10 minut w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C i przenieść supernatanty do nowych probówek. Wyrzuć granulkę. Przechowywać supernatanty z drugiego zestawu sześciu płytek (rysunek 1) na lodzie do późniejszej analizy lizatu całego komórki.
4. Przygotowanie kulek anty-GFP do immunoprecypitacji PD-1-GFP z lizatów transfekowanych PD-1-GFP z pierwszego zestawu (cztery płytki) (ryc. 1).
   1. Aby zapobiec osiadaniu koralików, przed otwarciem delikatnie potrząśnij butelką z koralikami. Usunąć 40 μl kulek anty-GFP z gnojowicy na każdy warunek.
   2. Wirować w temperaturze 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant w celu umycia kulek.
      nuta: Ważne jest, aby zminimalizować kontakt plastikowych końcówek pipet z kulkami agarozy, aby zapobiec ich utracie. Zaleca się przecięcie krawędzi końcówki o pojemności 200 μl przed przeniesieniem kulek do innej tuby.
   3. Ponownie zawiesić kulki w 80 μl buforu do lizy (na próbkę).
5. Dodaj umyte kulki bezpośrednio do lizatu komórkowego (PNS) z komórek wykazujących ekspresję PD-1-GFP z pierwszego zestawu (cztery płytki) (krok 1.3). Obracać w temperaturze 0,005 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu immunoprecypitacji białek znakowanych GFP.
6. Umyj kulki 1 ml zimnego buforu do lizy (bez ortowanadatu) 3 razy. Odwirować probówkę o masie 2 500 x g przez 10 s.
   nuta: Dodając bufor do lizy do kulek, dodaj go bezpośrednio na kulki, nie dotykając ich końcówkami. Nie ma potrzeby pipetowania w górę i w dół podczas mycia.
7. Równo podzielić lizat aktywnego SHP2 z pierwszego zestawu (jedna płytka; krok 1.3) i dodać go do trzech probówek z przemytymi kulkami zawierającymi PD-1-GFP (WT PD-1-GFP i dwie różne mutacje z niedoborem fosfo, Y223F i Y248F). Dodać jedną trzecią objętości z lizatu komórek nietransfekowanych do drugiej probówki kulek WT PD-1-GFP. Odrzuć pozostałe dwie trzecie.
8. Inkubować kulki przez 4 godziny w temperaturze 4 °C z delikatnymi obrotami (0,005 x g).
9. Przemyć kulki dwukrotnie 1 ml zimnego buforu do lizy (bez perwanadatu lub ortowanadatu), jak podano w kroku 1.6.
10. Dodać 80 μl buforu do lizy (bez perwanadatu lub ortowanadatu) na próbkę, upewniając się, że całkowita objętość w każdej probówce wynosi 100 μl (20 μl kulek i 80 μl buforu do lizy). Delikatnie wymieszaj i przenieś 50 μl z każdej probówki do dwóch świeżych probówek o pojemności 1,5 ml.
    nuta: Po tym kroku będą dwie probówki wypełnione mieszaniną zawierającą kulki i bufor do lizy. Jedna z probówek zostanie wykorzystana do badania współimmunoprecypitowanego SHP2 metodą western blot.

2. Analiza SHP2 Western Blot

1. Zakręć koraliki i usuń supernatant.
2. Dodać 20 μl 2x buforu Laemmli (patrz tabela materiałów) do kulek i gotować w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
3. Zmierz stężenie białka w kontrolkach wejściowych (drugi zestaw) za pomocą zestawu BCA (patrz tabela materiałów). Przenieść 30 μl najbardziej rozcieńczonej próbki do nowej probówki. Rozcieńczyć pozostałe wejściowe kontrole buforem do lizy do tego samego stężenia co najbardziej rozcieńczona próbka i przenieść 30 μl z każdej z nich do nowej probówki.
   nuta: Po tym kroku będą 4 probówki po 30 μl każda, o podobnych stężeniach białka, reprezentujące wejściowe lizaty kontrolne.
4. Dodać równe objętości 2x buforu Laemmli do lizatów i gotować w temperaturze 95 °C przez 5 minut. Odwirować kulki i załadować supernatant na 4–20% żelu na bazie SDS-PAGE Tris (patrz tabela materiałów) do analizy western blot. Ponadto załadować 50 μl z każdej próbki z drugiego zestawu.
5. Kontynuuj analizę western blot.

Wyniki

Rysunek 1: Warunki eksperymentalne i strategia. GFP-PD-1 WT (typ dziki), GFP-PD-1 Y223F (mutant ITIM) lub GFP-PD-1 Y248F (mutant ITSM) ulegały ekspresji w komórkach HEK 293T, które następnie traktowano perwanadatem. Ufosforylowane białka GFP-PD-1 zebrane przez immunoprecypitację GFP zmieszano z lizatami z komórek z nadekspresją SHP2 i zarejestrowano poziomy i aktywność SHP2 związanego z każdą wers...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Membrany nitrocelulozowe	General Electric	10600004
Mikrowirówka	Eppendorf	5424-R	1,5 ml
BCA (Kodeks Postępowania	rybak	Numer katalogowy: 23225	Test kwasu bichinowego
Anty-SHP2	Santa Cruz	Zobacz materiał SC-280
Anty-GFP-agaroza	Język MBL	Zobacz materiał D153-8
Ochrona przed GFP	Roche	118144600
Anty-aktyna	Santa Cruz	SC-1616 (wersja angielska)
Ogniwa HEK-293	Kontroler ATCC (Kontroler T	CRL-1573
Orthovanadate (Orthovanadate)	Sigma	Zobacz materiał S6508
Koktajl inhibitorów proteazy	Roche	11836170001	Nie zawiera EDTA
Bufor do próbek tris-glicyny SDS (2x)	Invitrogen	LC2676	Zmodyfikowany bufor Laemmli
4-20% mini żele tris-glicyny	Invitrogen	XP04205BOX	15-dołkowy
Trypsyna-EDTA (0,25%) czerwień fenolowa	Gibco (firma Gibco)	25200114
Zawartość NaCl	Sigma	Zobacz materiał S7653	chlorek sodu

powiedział: powiedział: powiedział: