Metoda analizy oparta na teście ELISA do analizy interakcji między białkami przynęty i ofiary

Streszczenie

Źródło: Singh, B. et al., Testy do badania roli witronektyny w adhezji bakteryjnej i oporności surowicy. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film opisuje technikę opartą na ELISA, która wykrywa interakcje białko-białko między dwoma białkami poprzez pomiar wiązania drugiego białka z unieruchomionym pierwszym białkiem. Związane drugie białko jest wykrywane za pomocą specyficznych przeciwciał znakowanych enzymem, takim jak peroksydaza chrzanowa.

Protokół

1. Analiza ELISA interakcji między rekombinowanym PH i Vn

UWAGA: Kontrolki muszą być dołączone, aby wykluczyć niespecyficzne powiązania. Ludzki czynnik H (FH) lub białko wiążące C4b (C4BP) są stosowane odpowiednio jako kontrole pozytywne i ujemne.

1. Rozcieńczyć każde z ludzkich białek (Vn, FH i C4BP) oddzielnie do 50 nM w Tris-HCl, pH 9,0 (bufor otoczkowy). Dozować 100 μl roztworu białkowego do każdego dołka płytki do mikromiareczkowania Polysorp. Zamknąć płytki pokrywką i przechowywać je w temperaturze 4 °C przez noc (16 godzin), aby ułatwić unieruchomienie białka na dołkach na płytki do mikromiareczkowania.
....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Czujniki AR2G	Pall Nauki przyrodnicze	Numer katalogowy: 18-5095	Czujnik do unieruchomionego białka za pomocą sprzężenia aminowego
aceton	Firma VWR	Numer katalogowy: 97064-786	Ocena analizy
Albuminy surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	Certyfikat A2058	Nadaje się do hodowli komórkowych
C4BP (białko wiążące C4b)	Complement Technology, Inc.	Ciągnik siodłowy A109	Kupiony jako zamrożona postać płynna
Kwas cytrynowy	Sigma-Aldrich	251275-500G	Ocena Amerykańskiego Towarzystwa Chemicznego (ACS)
Przeciwciała anty-He tag sprzężone z HRP	Księga Abcam	ab1269 powiedział	Poliklonalny
Zobacz materiał C4BP	Complement Technology, Inc.	Ciągnik siodłowy A109	Zamrożony roztwór
Kolumna żywicy o powinowactwie do histydyny (HisTrap HP)	GE Health Care Nauki przyrodnicze	Numer katalogowy: 17-5247-01	Kolumny wypełnione Ni Sepharose
Oznaczone przez niego PH			Rekombinowana ekspresja i oczyszczanie w naszym laboratorium
Metano	Firma VWR	BDH1135-1LP	Ocena analizy
Plazmid zawierający C-koniec 6x His-tag na szkielecie (pET26(b))	Novagen	Numer katalogowy: 69862-3	Wektor DNA
Płytki do mikromiareczkowania Polysorb	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M9410	Dla testu ELISA
Tetrametylobenzydyna	Sigma-Aldrich	860336-100MG	Klasa ELISA
Witronektyna (Vn) z osocza ludzkiego	Sigma-Aldrich	V8379-50UG	Klasa hodowli komórkowej

: