Metoda analizy oparta na teście ELISA do analizy interakcji między białkami przynęty i ofiary

Abstract

Źródło: Singh, B. et al., Testy do badania roli witronektyny w adhezji bakteryjnej i oporności surowicy. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film opisuje technikę opartą na ELISA, która wykrywa interakcje białko-białko między dwoma białkami poprzez pomiar wiązania drugiego białka z unieruchomionym pierwszym białkiem. Związane drugie białko jest wykrywane za pomocą specyficznych przeciwciał znakowanych enzymem, takim jak peroksydaza chrzanowa.

Protocol

1. Analiza ELISA interakcji między rekombinowanym PH i Vn

UWAGA: Kontrolki muszą być dołączone, aby wykluczyć niespecyficzne powiązania. Ludzki czynnik H (FH) lub białko wiążące C4b (C4BP) są stosowane odpowiednio jako kontrole pozytywne i ujemne.

1. Rozcieńczyć każde z ludzkich białek (Vn, FH i C4BP) oddzielnie do 50 nM w Tris-HCl, pH 9,0 (bufor otoczkowy). Dozować 100 μl roztworu białkowego do każdego dołka płytki do mikromiareczkowania Polysorp. Zamknąć płytki pokrywką i przechowywać je w temperaturze 4 °C przez noc (16 godzin), aby ułatwić unieruchomienie białka na dołkach na płytki do mikromiareczkowania.
2. Wyrzuć roztwór z płytki do mikromiareczkowania, przechylając ją do góry nogami nad zlewem i umyj studzienki trzykrotnie 300 μl PBS/studzienkę. Zatkać powlekane studzienki na 1 godzinę w temperaturze pokojowej z PBS zawierającym 2,5% (w/v) BSA (PBS-BSA).
3. Po usunięciu roztworu blokującego przemyć studzienki trzykrotnie 300 μl PBS zawierającego 0,05% (v/v) Tween 20 (PBST) na studzienkę. Dodać 100 μl rekombinowanego pH znakowanego His o stężeniu 50 nM do każdej studzienki próbki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze suchej. W studzienkach kontrolnych dodać tylko 100 μl PBS-BSA.
   nuta: Gen lph kodujący PH z Hif został amplifikowany metodą PCR i sklonowany do wektora ekspresyjnego pET26b, który dodaje znacznik 6× His na C-końcu wyrażonego białka. Wektor rekombinowany przekształcono w E. coli BL21(DE3) w celu ekspresji. Do oczyszczenia rekombinowanego białka użyto żywicy Ni-NTA.
4. Odrzucić roztwór białkowy i usunąć niezwiązane białka, przemłukując studzienki trzykrotnie 300 μl PBST na studzienkę. Dodać 100 μl PBS-BSA zawierającego anty-His pAbs sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP) (rozcieńczenie 1:10 000) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
5. Przygotować 20 mM roztwór A, rozpuszczając tetrametylobenzydynę w roztworze 5% acetonu i 45% metanolu. Aby przygotować roztwór B, rozpuść 19,2 g kwasu cytrynowego w 1000 ml_H2O, dostosuj pH do 4,25 przez dodanie KOH, a następnie dodaj 230 μl 30%_H2O2. Przechowuj oba roztwory w ciemności w RT. Tuż przed użyciem wymieszaj 500 μl roztworu B z 9,5 ml roztworu A, aby przygotować odczynnik do wykrywania ELISA.
6. Przemyć studzienki trzykrotnie 300 μl PBST na studzienkę i wykryć kompleksy antygen-przeciwciało, dodając 100 μl odczynnika wykrywającego ELISA do każdej studzienki.
7. Dodać 50 μl 1 M H₂SO₄ / studzienkę, aby zatrzymać reakcję. Zmierzyć gęstość optyczną studzienek przy 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Czujniki AR2G	Pall Nauki przyrodnicze	Numer katalogowy: 18-5095	Czujnik do unieruchomionego białka za pomocą sprzężenia aminowego
aceton	Firma VWR	Numer katalogowy: 97064-786	Ocena analizy
Albuminy surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	Certyfikat A2058	Nadaje się do hodowli komórkowych
C4BP (białko wiążące C4b)	Complement Technology, Inc.	Ciągnik siodłowy A109	Kupiony jako zamrożona postać płynna
Kwas cytrynowy	Sigma-Aldrich	251275-500G	Ocena Amerykańskiego Towarzystwa Chemicznego (ACS)
Przeciwciała anty-He tag sprzężone z HRP	Księga Abcam	ab1269 powiedział	Poliklonalny
Zobacz materiał C4BP	Complement Technology, Inc.	Ciągnik siodłowy A109	Zamrożony roztwór
Kolumna żywicy o powinowactwie do histydyny (HisTrap HP)	GE Health Care Nauki przyrodnicze	Numer katalogowy: 17-5247-01	Kolumny wypełnione Ni Sepharose
Oznaczone przez niego PH			Rekombinowana ekspresja i oczyszczanie w naszym laboratorium
Metano	Firma VWR	BDH1135-1LP	Ocena analizy
Plazmid zawierający C-koniec 6x His-tag na szkielecie (pET26(b))	Novagen	Numer katalogowy: 69862-3	Wektor DNA
Płytki do mikromiareczkowania Polysorb	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M9410	Dla testu ELISA
Tetrametylobenzydyna	Sigma-Aldrich	860336-100MG	Klasa ELISA
Witronektyna (Vn) z osocza ludzkiego	Sigma-Aldrich	V8379-50UG	Klasa hodowli komórkowej